约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其基因和应用，约安巨马陆抗血栓肽Joannsin是约安巨马陆镇痛肽基因编码的一种单链多肽，分子量8910.9道尔顿，等电点7.60。约安巨马陆抗血栓肽Joannsin由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。编码约安巨马陆抗血栓肽Joannsin的基因，由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成。约安巨马陆抗血栓肽Joannsin在制备FXa、trypsin抑制剂和抗血栓药物中的应用。本发明专利技术从约安巨马陆防御腺内分离到的Joannsin序列经原核表达获得的Joannsin重组多肽能够抑制trypsin、FXa的活性，并且在体内表现极显著的抗血栓功能；另外该多肽经原核表达获得，容易大规模工业化生产并且抗血栓活性强，能够作为抑制FXa的试剂和制备抗血栓药物。

Ioan giant Malu antithrombotic peptides Joannsin and its application

The invention belongs to the field of biomedical technology, in particular to a giant Ioan Malu antithrombotic peptide Joannsin gene and application thereof, Ioan giant millipede antithrombotic peptide Joannsin is a single chain polypeptide gene encoding giant Ioan Malu analgesic peptide, molecular weight and isoelectric point of 7.60 and 8910.9 Dalton. Composition of amino acid sequence of giant Ioan Malu antithrombotic peptides Joannsin as shown by SEQ ID NO:1. Ioan encoding giant Malu antithrombotic peptides Joannsin gene composed of nucleotide sequence shown by SEQ ID NO:2. Ioan giant Malu antithrombotic peptides Joannsin in the preparation and application of FXa, trypsin inhibitors and antithrombotic drugs in. The present invention isolated from giant Ioan defense gland Joannsin sequence involved by prokaryotic expression of recombinant Joannsin peptide can inhibit trypsin and FXa activity, and in vivo showed significant antithrombotic function; in addition to the polypeptide obtained by prokaryotic expression, easy mass production and antithrombotic activity, can as for the preparation of FXa reagent and inhibition of antithrombotic drugs.

【技术实现步骤摘要】
约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其应用
本专利技术提供一种约安巨马陆(Prospirobolusjoannsi)抗血栓肽Joannsin及其编码基因和应用，属于生物医学

技术介绍
蛋白酶广泛存在于从病毒、细菌到哺乳动物的所有生物中，并在许多生理反应中起着重要的作用，例如食物消化、凝血、组织重建、免疫防御等，在这些生理过程中，蛋白酶调节着一系列胞内和胞外的蛋白水解级联反应。蛋白酶一旦被激活，将导致一系列迅速而不可逆的特异细胞反应。尽管蛋白酶是机体生理反应所必须的，但过量的蛋白酶对机体蛋白质内环境却是一种潜在的危险，所以蛋白酶抑制剂对生物的稳态是不可缺少的，同时在许多有毒动物中，蛋白酶抑制剂作为其捕食或者抵御捕食者中发挥着重要的作用。目前，在自然界中共发现了四种蛋白酶抑制剂：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和凝血因子X等的丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶等的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，抑制胶原酶、氨肽酶和嗜热菌蛋白酶等的金属蛋白酶抑制剂，及抑制组织蛋白酶D、逆转录蛋白酶和胃蛋白酶等的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂的种类最多。根据序列同源性、半胱氨酸数目和分子中二硫键与作用位点之间的拓扑学关系，丝氨酸蛋白酶抑制剂又分为Serpin、TIL(trypsininhibitorlikecysteinerichdomain)、Kazal、Kunitz和Bowman-Birk等几个家族。凝血系统包括内源途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径：是指从因子Ⅻ激活，到因子X激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子Ⅻ即与之结合，在HK和PK的参与下被活化为Ⅻa。在不依赖钙离子的条件下，因子Ⅻa将因子Ⅺ激活。在钙离子的存在下，活化的Ⅺa又激活了因子Ⅸ。单独的Ⅸa激活因子X的效力相当低，它要与Ⅷa结合形成1：1的复合物，又称为因子X酶复合物。这一反应还必须有Ca2+和PL共同参与；外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子Ⅹ被激活的过程。内源性凝血途径和外源性凝血途径都是通过Ⅹa、凝血酶共同的凝血途径完成最后的凝血过程；凝血途径由各种凝血因子组成，许多凝血因子都是丝氨酸蛋白酶，所以丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗凝血过程中可能会发挥一定的功能。由于外源性凝血系统和内源性凝血系统都汇合于Ⅹa、凝血酶共同的凝血途径，所以抗凝血抗血栓药物选择抑制Ⅹa、凝血酶看似是个绝佳的选择，但是临床结果表明，抑制Ⅹa、凝血酶这些共同的凝血途径，长时间用药可能会导致凝血功能障碍，引起出血，所以通过靶向其他的凝血因子或许是个更好的选择。最近的研究表明通过靶向FXII抑制凝血过程，不会对血液系统的稳态产生影响，Infestin-4是到现在为止发现的最强的FXII抑制剂，研究表明其作为抗凝药不会引起出血等；同时FXII的抗体也会产生抗血栓效应而不会产生出血的风险。蛋白酶抑制剂也广泛存在于动物、植物、真菌、细菌和病毒等生物体内，通过发掘生物质资源，并从生物中分离纯化出针对于内源性凝血途径和外源性凝血途径中的凝血因子的蛋白酶抑制剂，在抗血栓药物的研发中起着重要的作用。马陆(millipede)也叫千足虫、千脚虫、秤杆虫。马陆属于无脊椎动物，多足纲，倍足亚纲，体节组成。长约20～35厘米，暗褐色，背面两侧和步肢赤黄色。目前已经命名的有12000多种，估计全世界其有80000多种。从马陆的基因组中可以发现有许多蛋白酶抑制剂，但是马陆中的蛋白类或者多肽类活性分子目前还未见研究，所以通过转录组蛋白质组学分析或许可以发现马陆中个体防御功能的蛋白分子，使其遇见捕食者时不仅仅通过气味还能够通过这些多肽毒素来发挥抵御作用。我们首次从约安巨马陆中识别了一个作用很强的FXa和trypsin抑制剂Joannsin。本专利技术涉及的多肽Joannsin能够抑制血栓形成。通过动物模型证实它具有很强的抗血栓活性。将本专利技术的约安巨马陆抗血栓肽Joannsin全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。将本专利技术的约安巨马陆抗血栓肽Joannsin编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提出一种约安巨马陆抗血栓肽Joannsin及其编码基因和应用。约安巨马陆抗血栓肽Joannsin是约安巨马陆抗血栓肽基因编码的一种单链多肽，分子量8910.9道尔顿，约安巨马陆抗血栓肽Joannsin的氨基酸序列(EQIDNO：1)为：QAWQNYYRPSRAGYSYCYDDYDIGPCRARFRQWYYNRRTGECEIFFYGGCLGNDNKYESKEECEYICKKLLT。约安巨马陆抗血栓肽基因的克隆包括：约安巨马陆防御腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选约安巨马陆抗血栓肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’CGTACTGCCGTGGAACTTC3’，PCR另一扩增引物为3’PCRPrimer引物，其序列为5’CCGAGGTTTGGTGGCTCATT3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码约安巨马陆抗血栓肽的由659个核苷酸组成，自5’端至3’端序列(核苷酸序列SEQIDNO：2)为：TCAGTCACAGGACTTAATATCTGTCGAACCTTAAGACGTACTGCCGTGGAACTTCCAAAATTTCTTCATCTTTGCATGTACAGTAGCTCATATAAATTTTTCTGATTTTGAGACCGATTTAGGAAGGGAGAAAATAAATCAAGTCCAGTTTGTGAATTCTTAAAAACAAAGATGGACAATAGGTTTGTGGCACTGCTTACCGTCTTAGTCATCATGCACACACTGACATTCAGCAGAGGTCAAGCATGGCAGAATTACTATAGGCCTAGCCGTGCCGGTTATTCATACTGCTACGATGACTACGACATTGGGCCCTGCAGAGCCCGTTTTCGTCAGTGGTATTATAATAGACGTACCGGTGAATGTGAAATCTTTTTCTACGGGGGATGTTTGGGAAACGACAATAAATATGAGTCAAAAGAAGAATGCGAATATATCTGTAAGAAATTGCTCACGTAGCAAGAGTGTTCACTAATTATGACTGTTGACGAACACGTGTTAATTTGTTCAAGCAGTAAACGGATCATGACAGCACAATGAAATATAAAATTGTTGGAACTGTTACTCATGATTGGATTTTGATAAGTGTTGCCTTTTCACGGTGTTTCATAAACCATGTTTTAACAGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA这条核苷酸序列转录的多肽的氨基酸序列为：MDNRFVALLTVLVIMHTLTFSRGQAWQNYYRPSRAGYSYCYDDYDIGPCRARFRQWYYNRRTGECEIFFYGGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
约安巨马陆抗血栓肽Joannsin，其特征在于：该抗血栓肽中包含以下多肽，多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.约安巨马陆抗血栓肽Joannsin，其特征在于：该抗血栓肽中包含以下多肽，多肽的氨基酸序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述的约安巨马陆抗血栓肽Joannsin，其特征在于：该抗血栓肽分子量8910.9道尔顿，等电点7.60。3.权利要求1所述的约安巨马陆抗血栓肽Joannsin的编码基因，其特征在于，包含以下核苷酸序列SEQIDNO：2。4.权利要求1所述的约安巨马陆抗血栓肽Joannsin的编码基因的制备方法：约安巨马陆防御腺总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选约安巨马陆抗血栓肽基因；扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’CGTACTGCCGTGGAACTTC3’，PCR另...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖仞，栾宁，段自磊，严秀文，莫国香，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32