本发明专利技术公开了检测猪NLRP12的核苷酸序列和应用，该检测猪NLRP12的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2分别为检测猪NLRP12的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO.3为检测猪NLRP12的荧光探针。本发明专利技术进一步公开了利用上述引物和探针检测猪NLRP12的方法。结果显示：该法特异性好，灵敏度高，能够快速、准确的检测猪组织器官样本中NLRP12，在研究NLRP12炎性体时能够对其进行实时监测，及时了解和掌握炎症的发生过程和发展进程，具有重要的理论意义和实践意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于畜牧业动物医学技术研究领域，涉及基于TaqMan水解探针荧光RT-PCR检测猪NLRP12的核苷酸序列和方法，适用于猪组织样本，包括胃、小肠、大肠等消化道组织以及肝脏、脾脏、淋巴结、肺脏等组织器官中NLRP12的准确检测，更具体的说是用于猪组织器官中NLRP12mRNA的表达分析、炎症反应机制研究和肠道屏障功能研究等方面的应用。
技术介绍
NOD-样受体（NOD-likereceptors，NLRs）是先天性免疫中的一大类病原模式识别受体。机体依靠NLRs识别病原感染的信号，启动免疫应答，发挥抵抗病原微生物感染的作用。NLRP12是NLRs家族的一个成员，广泛存在于消化道组织、免疫器官组织以及免疫细胞中，参与病原识别和炎性体组成。炎性体活化后激活胱冬肽酶（caspase-1），调控白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）家族中促炎性细胞因子IL-1b、IL-18和IL-33的生成，参与调节机体炎症反应和肠道黏膜屏障功能。促炎性细胞因子的释放，能够促进局部炎性细胞浸润，减轻或加重组织炎性损伤状态。适度炎症反应有助于消除内外源致病因素，使机体内环境处于稳态；慢性、失调的炎症反应则持续地损伤细胞和组织，促使组织器官异常重构，最终导致器官功能衰竭甚至丧失。因此，研究不同病原体引起炎症的机制，有利于控制炎症的发生以及炎症的进程，使炎症反应朝向对机体有益的方向发展，促进机体顺利恢复到健康的状态和水平。NLRP12是近两年来研究较多的一种病原识别受体，主要集中在模型动物小鼠的研究上，在人上的研究也仅有少量报道，但是在猪上的研究还未见报道。很多动物病原体感染猪后，都会引起炎症反应，但不同的感染类型其引起炎症反应的机制也各不相同。中国是养猪大国，猪的健康养殖关系和影响着食品安全问题。因此，研究研究猪疫病炎症反应的发生机制，控制炎症反应的进程，使猪只早日恢复健康，就显得非常重要。一方面，可以减少药物尤其是抗生素类药物的使用量，保证猪肉食品的安全，另一方面，还可以降低养殖成本，提高养猪业的经济效益。在本研究中，我们采用TaqMan荧光RT-PCR方法建立了检测猪NLRP12的检测技术，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选、Mg2+使用浓度的优化、引物及探针使用浓度的优化。建立了灵敏、特异，能够用于检测猪NLRP12mRNA表达的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测猪NLRP12的核苷酸序列，包括引物序列和基于MGB修饰的短探针序列。本专利技术的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于MGB修饰的检测猪NLRP12mRNA表达的方法。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的技术方案：一组检测猪NLRP12的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.3所示，其中SEQIDNO.1至SEQIDNO.2分别为检测猪NLRP12的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO.3为检测猪NLRP12的荧光探针。本专利技术所所述探针序列SEQIDNO.3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。本专利技术进一步公开了采用检测猪NLRP12的核苷酸序列进行检测的方法，其特征在于，由以下组分作为检测NLRP12所用的必备材料：1）裂解液；2）RT反应液，包括：5´RT缓冲液、25mMMgCl2、2.5mMdNTPs（each）、200mM随机引物、40U/mLRNase抑制剂、200U/mL反转录酶M-MLV；3）qPCR反应液，包括：10´PCR缓冲液、25mMMgCl2、2.5mMdNTPs（each）、2.5U/mLTaqDNA聚合酶、20mM正义引物、20mM反义引物、20mM荧光探针；4）DEPC水：用自来水三次蒸馏获取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37°C搅拌处理12h，121°C高压蒸汽灭菌15min；5）猪NLRP12标准品：为体外转录的RNA片段，猪NLRP12标准品的序列为序列表SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；其中，正义引物为序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，其中5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。所述RT反应液中各成分的使用浓度为1´RT缓冲液、2.5mMMgCl2、0.25mMdNTPs、20mM随机引物、1U/mL的RNase抑制剂、5U/mL的反转录酶M-MLV；所述qPCR反应液中各成分的使用浓度为1´PCR缓冲液、3.5mMMgCl2、0.2mMdNTPs、0.05U/mLTaqDNA聚合酶、0.2mM正义引物、0.2mM反义引物、0.1mM荧光探针；本专利技术更进一步公开了采用检测猪NLRP12的核苷酸序列检测猪NLRP12的方法在猪组织器官中NLRP12mRNA表达方面的应用。实验结果显示：本专利技术建立的荧光qPCR检测方法可以对病毒RNA进行相对定量，根据标准曲线Y=-4.67X+38.51（X代表Ct值，Y代表NLRP12的相对含量），可知Ct值越小，NLRP12的表达量相对越高。发病猪不同组织中NLRP12的表达均高于正常猪不同组织中NLRP12的表达，并且以发病猪淋巴结中NLRP12的表达量为最高。本专利技术更加详细的描述如下：选择猪NLRP12基因的特定序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为21个碱基左右，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物的熔解温度（Tm值）在60°C左右，引物间的Tm值相差小于2°C。探针的长度为16个碱基。一组检测猪NLRP12的核苷酸序列，如下：1）5ʹ-CACAAGGTGATGCTGGATTGG-3ʹ（SEQIDNO.1）2）5ʹ-CCCGGCAGTTGATGTAGAAGAC-3ʹ（SEQIDNO.2）3）5ʹ-[FAM]-ACGGGAAGCTCTTCCA-[MGB]-3ʹ（SEQIDNO.3）其中序列1）和2）分别为检测猪NLRP12基因的正义引物和反义引物，序列3）为检测猪NLRP12基因的MGB修饰的荧光短探针，探针的5ʹ端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3ʹ端标记淬灭基团MGB。我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了检测猪NLRP12的检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选、Mg2+使用浓度的优化、引物及探针使用浓度的优化，得到以下检测方法。本专利技术提供的一种检测猪NLRP12的方法，由以下内容组成：1）RNA提取试剂盒：购自天根生化科技（北京）有限公司。2）RT反应液，表1为RT反应液配方：表1RT反应液配方反转录酶M-MLV（200U/mL）、5´RT缓冲液、随机引物（200mM）、RNase抑制剂（40U/mL）购自大连宝生物生物工程有限公司；dNTPs（2.5mMeach）、MgCl2（25mM）购自天根生化科技（北京）有限公司。3）qPCR反应液，表2为qPCR反应液配方：表2qPCR反应液配方TaqDNA聚合酶（2.5U/mL）、10´PCR缓冲液、dNTPs（本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测猪NLRP12的核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示，其中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2分别为检测猪NLRP12的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO.3为检测猪NLRP12的荧光探针。
【技术特征摘要】
1.一组检测猪NLRP12的核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1至SEQIDNO.3所示，其中SEQIDNO.1至SEQIDNO.2分别为检测猪NLRP12的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO.3为检测猪NLRP12的荧光探针。2.权利要求1所述的检测猪NLRP12的核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQIDNO.3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。3.一种采用权利要求1所述的核苷酸序列检测猪NLRP12的方法，其特征在于，由以下组分作为检测NLRP12所用的必备材料：1）裂解液；2）RT反应液，包括：5´RT缓冲液、25mMMgCl2、2.5mMdNTPs、200mM随机引物、40U/mLRNase抑制剂、200U/mL反转录酶M-MLV；3）qPCR反应液，包括：10´PCR缓冲液、25mMMgCl2、2.5mMdNTPs（each）、2.5U/mLTaqDNA聚合酶、20mM正义引物、20mM反义引物、20mM荧光探针；4）DEPC水：用自来水三次蒸馏获取三蒸水，在三蒸水中加入DEPC至终浓度为0.1%，37°C搅拌处理12h，121°C高压蒸汽灭菌15min；5）...
【专利技术属性】
技术研发人员：李海花，乔家运，兰璞，张蕾，白朋勋，王文杰，
申请(专利权)人：天津市畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。