本发明专利技术涉及用于检测靶重亚硫酸盐转化的甲基化的核苷酸序列的改进组合物和方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】重亚硫酸盐转化的核音酸序列的检测[000。 背景 重亚硫酸盐测序化isulfitesequencing)是使用重亚硫酸盐来测定DNA的甲基化模 式的方法。DNA甲基化是设及对胞喀晚或腺嚷岭DNA核巧酸添加甲基的生物化学过程。当 细胞分裂且由胚胎干细胞分化成特定组织时，DNA甲基化稳定地改变细胞中的基因表达。在 重亚硫酸盐测序(也称为重亚硫酸盐转化化isulfiteconversion))中，祀核酸首先用重亚 硫酸盐试剂进行处理，所述重亚硫酸盐试剂将未甲基化的胞喀晚特异性转化为尿喀晚，而 对甲基化的胞喀晚没有影响。一个不希望的重亚硫酸盐转化结果是原始祀的双链构象由于 序列互补性的丧失而被破坏。祀序列在样品制备和分析或诊断测试期间作为两条分开的单 链DNA存在。祀核酸序列通常还W极低浓度存在。运是对于循环肿瘤DNA例如SEPTIN9 (mS9)的情况尤其重要的考虑。因此，需要的是在重亚硫酸盐转化后的祀核酸序列的增强检 测的试剂和方法。[000引专利技术概述 本专利技术设及用于在重亚硫酸盐转化(也称为重亚硫酸盐测序或重亚硫酸盐处理）后的 祀核酸的增强检测的试剂和方法。本专利技术通过提供用于祀核酸的增强检测的试剂和方法来 解决该需要。本专利技术还教导了本文教导的方法的一般应用的策略。 本专利技术的测定设计策略是确保由于通过重亚硫酸盐处理引起的化学转化而形成 的两条核酸链均充当分析测试的祀。合适的分析测试的实例是祀扩增和/或信号扩增。极 低浓度的核酸的检测通过祀向在未甲基化的胞喀晚至尿喀晚转化后的两条链得到改进，与 现有技术中常用的单链检测相反。 在本专利技术的一个实施方案中，提供了对于甲基化的SEPTIN9基因（mS9)特异性的 引物。在运点上，本专利技术还设及也提供用于扩增来自人的核酸样品中的mS9的一组引物。引 物组包含选自下述的至少一种引物： (a) 在其3'末端处包含核巧酸序列AA如括如m城化iTA枉n'C;转EQ沿NO;明的寡核 巧酸， (b) 在其3'末端处包含核巧酸序列CTACCCACGAAX;C;ATC：巧燃股NO;巧的寡核巧 酸， (C)在其3'末端处包含核巧酸序列従化:献说獻TC病T.ATC巧龄3沿攸巧的寡核巧 酸。 本专利技术考虑了检测用重亚硫酸盐试剂处理的包含至少一个未甲基化的胞喀晚残 基的核巧酸序列的方法，其包括：提供i)怀疑包含祀核酸的样品，ii)对于重亚硫酸盐转化 的核酸有义链特异性的一种或多种引物，iii)对于重亚硫酸盐转化的核酸反义链特异性的 一种或多种引物；扩增样品中存在的任何祀核酸的有义链和反义链两者；且检测任何经扩 增的核酸。 本专利技术并不限于任何具体样品或样品类型。例如，样品材料可W包括体液，包括血 浆、血清、血液、脊髓液、精液、阴道分泌液、疲和唾液、脑脊液、淋己液和消化液。其他样品材 料可w包括分离或富集的细胞群体和组织。样品可w是新鲜的或固定的(保存的)。固定的 样品可W是包埋的(例如石蜡包埋的)。进一步地，样品可W得自考古发掘，即史前组织例如 骨可W产生可W通过本专利技术的方法富集或分离的核酸。某些样品类型可能需要预处理，W 例如浓缩样品（通过例如悬浮细胞的离屯、）或破碎化reakapart)大的样品来源(例如骨的 研磨或组织的消化性分解)。此类预处理主要是获得可更容易地通过本专利技术的方法操作的 原材料。就组织而言，核酸可W来源于组织、疲、粪便、尿或脑脊液。 进一步考虑样品怀疑包含mS9。进一步地，考虑样品得自筛选结肠直肠癌的主体和 /或怀疑患有结肠直肠癌的主体和/或对结肠直肠癌进行治疗的主体。进一步考虑所述样 品中的扩增核酸与先前取自相同主体的一种或多种样品相比较。 附图简述 图1显示了在重亚硫酸盐处理前和后的原始和互补序列的序列。处理破坏处理后的两 条链的互补性。"￡"是甲基化的胞喀晚。 图2显示了其中仅祀向一条链（mOl)的现有技术方法。 图3显示了其中祀向两条链（mOl和m02)的本专利技术的进步。 专利技术详述 定义 下述定义与本公开内容有关： 术语"约"指与所述值大约+/-10%的变化。应当理解此类变化始终包括在本文提供的 任何给定值内，无论是否对其做出具体提及。 术语"重亚硫酸盐试剂"指包含重亚硫酸盐（bisulfite)、焦亚硫酸盐 (disulfite)、亚硫酸氨盐化y化ogensulfite)或其组合的试剂，其如本文公开的可用于区 分甲基化和未甲基化的CpG二核巧酸序列。 在本公开内容的背景下的术语"等位基因特异性引物"指与祀序列杂交的引物(参 见"引物")，使得引物的3'端，通常为3'核巧酸与目的位点例如mS9序列对齐，并且在目的 祀核酸的密码子处与野生型等位基因或突变体等位基因确切互补。等位基因特异性引物的 使用允许基于在核酸例如DNA扩增期间的延伸产物的差异形成来区别等位基因。 术语"可检测寡核巧酸"指在合适的条件下与祀核酸选择性杂交并且可W被检测 的寡核巧酸。 术语"高亲和力核酸类似物"指与互补核酸例如脱氧核糖核酸（DNA)杂交的经修饰 的核酸，其亲和力高于具有相同碱基序列的未经修饰的核酸。高亲和力核酸包括但不限于 锁核酸（LNA)、肤核酸（PNA)、己糖醇核酸（HNA)、氨基憐酸醋等。 术语"杂交"指通过两条单链核酸之间的互补碱基配对形成双链体结构。杂交可 W在确切互补的核酸链之间或含有少数错配的互补核酸链之间发生。 术语"核酸"、"多核巧酸"和"寡核巧酸"指引物、可检测寡核巧酸和寡聚物，与长度 无关，并且包括多脱氧核糖核巧酸、多核糖核巧酸W及任何其他经修饰的/未经修饰的嚷 岭/喀晚碱基的N-糖巧。实例包括单链DNA(SsDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(SsRNA) 和双链RNA(dsRNA)。此类分子可W包含憐酸二醋键或经修饰的键，包括但不限于憐酸= 醋、氨基憐酸醋、硅氧烷、碳酸醋、簇甲基醋、乙酷胺醋（acetamidate)、氨基甲酸醋、硫酸、桥 接氨基憐酸醋、桥接亚甲基麟酸醋、硫代憐酸醋、甲基麟酸醋、二硫代憐酸醋、桥联硫代憐酸 醋或讽键及其组合。此类分子可w包含腺嚷岭、鸟嚷岭、胸腺喀晚、胞喀晚和/或尿喀晚，w及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。可替代地或另外地，此类分子可W包含一个或多个 经修饰的糖部分。 术语"肤核酸（PNA)"指其中正常憐酸二醋主链替换为N-(2-氨乙基）甘氨酸链的 合成DNA类似物。它的核碱基W相同的A-T(U)和G-C方式互补DNA或RNA(Nielsen等 人，Science254: 1497-1500 (1991) ;Hanv巧等人，Science258: 1481-1485 (1992);和 E曲olm等人，化Uire365: 566-568 (1993))。人工主链致使PNA对核酸酶抗性。PNA可W 依照本领域已知的方法合成(参见例如Hyrup等人，Bioorg.Med.化em. 4: 5-23 (1996); 国际专利申请公开号WO92/20702和92/20703 ;和美国专利号5, 539, 082,所述参考文献全 部的内容关于运点的教导通过引用并入本文)。两个重要的特点使得PNA成为用于特异性 等位基因的优良PCR夹。它不能充当聚合的引物。它不能充当通过Taq聚合酶的核酸外切 酶活性的底物。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测用重亚硫酸盐试剂处理的包含至少一个未甲基化的胞嘧啶残基的核苷酸序列的方法，其包括：a. 提供i）怀疑包含靶核酸的样品，ii）对于重亚硫酸盐转化的核酸有义链特异性的一种或多种引物，iii）对于重亚硫酸盐转化的核酸反义链特异性的一种或多种引物；b. 扩增所述样品中存在的任何靶核酸的有义链和反义链两者；和c. 检测任何经扩增的核酸。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄诗海，EN格拉纳多斯，
申请(专利权)人：雅培分子公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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