一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，该方法不需要对核酸进行前期的氢氧化钠变性处理，且不同于市面上商品化试剂采用的变温转化条件，可在恒温条件下进行转化实验；采用磁珠法进行甲基化核酸转化后的核酸纯化，利用高盐低pH值进行核酸的分离纯化，再通过低盐高pH值进行洗脱，且在纯化过程中不使用目前市场上均采用的氢氧化钠进行去磺化步骤，同时只采用一次洗涤步骤，能够得到高转化率、高质量、高纯度的DNA。本发明专利技术的方法具有操作快速简便、提高转化效率、提取效率和提取纯度的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸甲基化转化及纯化领域，涉及一种DNA在恒温条件、变性剂及DNA保护试剂下，使用亚硫酸盐转化DNA，并使用纯化试剂进行转化DNA纯化，并应用于各类分子生物学研究。
技术介绍
甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化，本专利技术所涉及为DNA甲基化。DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。1％-2％的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。目前研究DNA甲基化的方法有很多种，但都需要经过DNA亚硫酸盐转化后，再运用各种检测手段进行相关研究。DNA在亚硫酸盐转化过程中会使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。因此，可以结合NGS、MSP、HRM等方法来检测分析DNA序列哪些位点发生甲基化。亚硫酸盐转化的原理非常简单，目前的亚硫酸盐转化基本步骤分为：DNA的分离纯化，氢氧化钠变性、亚硫酸盐变温转化及脱磺酸基和脱盐。但是亚硫酸盐转化的主要问题是需要首先对需要转化的核酸进行氢氧化钠变性，而后进行长时间的转化及变温过程，且需要氢氧化钠溶液进行脱磺酸基。在此过程中，会导致DNA的严重降解及片段化。除了DNA降解问题，亚硫酸盐转化后的DNA纯化方法没有较好的解决，目前商品化的试剂盒基本都是采用离心柱方法进行产物纯化，并且需要carrierRNA，同时需要多步洗涤过程，步骤过多而造成DNA损耗高、提取效率降低，而且此方法需要离心机，难于实现自动化操作且纯化效率低、操作繁琐、产率低。因此，基于目前表观遗传学的快速发展，以及目前的亚硫酸盐转化方法及纯化方法的一些问题，本专利技术对转化及纯化方法进行了优化改进，使DNA转化能够在70-90度范围进行转化45-90min，并采用磁珠法对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量及高纯度的DNA，并有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作，用于后续分子生物学研究，尤其临床分子诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，该方法能在恒温条件下(70-90℃)、同时在变性剂及DNA保护剂存在下进行亚硫酸盐转化并对转化DNA进行纯化，并结合简便的磁珠法纯化方法，能够快速得到高转化率、高质量、高纯度的DNA，本专利技术的方法有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。本专利技术涉及的DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括如下步骤：(1)在离心管中加入20-60ul的待处理DNA；(2)加入85-100ul转化溶液，再加入15-35ul保护溶液，混匀；(3)将离心管置于70-90℃恒温金属浴中45-90min；(4)冷却至室温，向其中加入300-600ul结合液及5-20ul磁珠溶液，混匀，室温放置10-20min；(5)将离心管置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，弃去上清液；(6)加入0.5-1ml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，弃去上清液；(7)在磁力架上静置1-5min，弃去上清液；(8)再加入40-100ul洗脱液，充分混匀后，20-65℃静置5-10min；(9)再将离心管置于磁力架上1-2min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase与RNase酶离心管中，-20度保存备用。上述技术方案中，所述的转化溶液为：含1-3MA组分和10-800mMB组分的水溶液，pH5.0-5.5，其中A组分为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中至少一种，B组分为尿素、甲酰胺、、二甘醇二甲醚、异硫氰酸胍中的至少一种；所述的保护溶液为：含50-700mMC组分和10-200mMD组分的水溶液，pH5.0-6.0，其中C组分为氢醌、三烯丙基异氰脲酸酯、水溶性维生素C、四乙烯五胺五盐酸盐中的至少一种，D组分为重亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中的一种；所述的结合液为：含0.5-6ME组分、10-500mMF组分和体积浓度为10-50％G组分的水溶液，pH5-7，其中E组分为异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠、碘化钠中至少一种，F组分为Tris-HCl和HEPES中的至少一种，G组分为异丙醇、无水乙醇中至少一种；所述的洗涤液为：含0.5-3MH组分和体积浓度为10-70％I组分的水溶液，pH5-7，其中H组分为异硫氰酸胍、盐酸胍、高氯酸钠中至少一种，I组分为异丙醇和无水乙醇中至少一种；所述的洗脱液为无DNase与RNase酶无菌水或tris缓冲液或TE缓冲液；所述的tris缓冲液为10mM的tris-HCl，pH7.5-8.5，所述的TE缓冲液中含10mM的tris-HCl和1mM的EDTA，pH7.5-8.5。所述的磁珠溶液为含浓度为50mg/ml纳米磁性颗粒的水溶液，具体为超顺四氧化三铁或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基或羧基的二氧化硅包被。本专利技术涉及的亚硫酸盐转化及纯化的方法，其可应用于脱氧核糖核酸转化及后续纯化，所纯化的转化DNA可用于各类分子生物学检测，尤其为临床分子诊断。本专利技术的方法具有如下优势：1、本专利技术涉及的甲基化转化试剂，不同于现有的转化方法，不需要对核酸进行前期的氢氧化钠变性处理，而且能在恒温条件下高效进行变性、转化且不降解及片段化DNA，整个转化时间只需要45-90min；同时可以使用恒温金属浴进行相关的转化实验，而不同于市面上商品化试剂需要价格昂贵的PCR仪进行变温转化，转化时间短、仪器设备简单，操作更简便。2、本专利技术涉及的磁珠法纯化试剂，适用于甲基化核酸转化后的核酸纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在离心管中加入20‑60ul的待处理DNA；(2)加入85‑100ul转化溶液，再加入15‑35ul保护溶液，混匀；(3)将离心管置于70‑90℃恒温金属浴中45‑90min；(4)冷却至室温，向其中加入300‑600ul结合液及5‑20ul磁珠溶液，混匀，室温放置10‑20min；(5)将离心管置于磁力架上2‑5min，待磁珠分离后，弃去上清液；(6)加入0.5‑1ml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2‑5min，待磁珠分离后，弃去上清液；(7)在磁力架上静置1‑5min，弃去上清液；(8)再加入40‑100ul洗脱液，充分混匀后，20‑65℃静置5‑10min；(9)再将离心管置于磁力架上1‑2min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase与RNase酶离心管中，‑20度保存备用。

【技术特征摘要】
1.一种DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在离心管中加入20-60ul的待处理DNA；
(2)加入85-100ul转化溶液，再加入15-35ul保护溶液，混匀；
(3)将离心管置于70-90℃恒温金属浴中45-90min；
(4)冷却至室温，向其中加入300-600ul结合液及5-20ul磁珠溶液，混匀，室温放置
10-20min；
(5)将离心管置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，弃去上清液；
(6)加入0.5-1ml洗涤液，充分混匀磁珠，然后置于磁力架上2-5min，待磁珠分离后，
弃去上清液；
(7)在磁力架上静置1-5min，弃去上清液；
(8)再加入40-100ul洗脱液，充分混匀后，20-65℃静置5-10min；
(9)再将离心管置于磁力架上1-2min，待磁珠分离后，转移上清液至一新的无DNase
与RNase酶离心管中，-20度保存备用。
2.根据权利要求1所述的DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述的转化溶
液为含1-3MA组分和10-800mMB组分的水溶液，pH5.0-5.5，其中A组分为重亚硫
酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中至少一种，B组分为尿素、甲酰胺、二
甘醇二甲醚、异硫氰酸胍中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其特征在于，所述的保护溶
液为含50-700mMC组分和10-200mMD组分的水溶液，pH5.0-6.0，其中C组分为氢
醌、三烯丙基异氰脲酸酯、水溶性维生素C、四乙烯五胺五盐酸盐中的至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，郑银娜，裘惠良，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州美联医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33