一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法。所述试剂盒包括反应液、阳性对照品、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条。所述的反应液包括呼吸道病原菌检测引物、dN(U)TP、UDG、PCR缓冲体系、DNA聚合酶，阳性性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒，阴性对照品包括人基因组DNA，荧光检测液包括链霉亲和素偶联的量子点，变性剂包括碱液，中性剂包括酸液，膜条包括偶联特异性检测探针的尼龙膜。所述试剂盒及方法能同时快速、灵敏、特性检测出11种常见下呼吸道感染的病原菌，设置的内源性内标可评估样本取样是否合格并能有效监控假阴性的出现，可辅助临床实现早诊断，早治疗。

A quantum dot nucleic acid detection kit and method for simultaneous detection of 11 pathogens in lower respiratory tract

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法。
技术介绍
呼吸道感染(Respiratorytractinfection，RTI)是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床症状和体征都较为相似，其临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道疾病是由细菌外的病原体引起，其中以呼吸道病毒最常见。呼吸道感染分为上呼吸道感染与下呼吸道感染。上呼吸道感染分为病毒性(70-80％)、细菌性(占20-25％)。急性上呼吸道感染：以急性鼻咽炎为主要表现的普通感冒、急性鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、咽炎、会厌炎等。急性下呼吸道感染：急性气管支气管炎、细支气管炎、肺炎，其中肺炎是5岁以下儿童死亡的最主要原因。急性下呼吸道感染为气管、支气管、肺组织发生的急性感染，包括急性气管、支气管炎和肺炎等，多发于寒冷季节，常由上呼吸道感染、鼻炎、流行性感冒(流感)等病毒或细菌向下蔓延而引起。好发于住院患者、小儿及机体免疫力低下者。目前临床病原菌检测主要依靠传统细菌培养和血清学检测相关抗体的方法，但由于操作方法繁琐，获得结果周期较长，每次只能鉴定一种病原体，且阳性检出率低，仅有30％～40％，因此建立一种高效、敏感、快速、准确的病原学检测方法，对临床早期诊断和精准治疗有着至关重要的作用。本专利技术提供一种能同时检测11种常见下呼吸道感染的细菌量子点基因芯片，具有高通量、高灵敏度、高特异性等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于针对常见的下呼吸道细菌感染引起的气管炎、支气管炎及肺炎，开发出一种能同时检测11种呼下吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒及方法，为临床诊断提供实验室依据，预防社区或院内感染。为解决上述的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，包括反应液、阳性对照品、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜及偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01N-1.5N的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01N-1.5N盐酸溶液；所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒，所述的阴性对照品包括人基因组DNA；所述的反应液包含以下检测引物：引物MCF：GTAGGTTATACCGAAGGTGC，即SEQIDNO:1；引物MCR：ATTCACCGCAAAGTTTACATTC，即SEQIDNO:2；引物TUF：GAAGAATTGCTTGAATTGGT，即SEQIDNO:3；引物TUR：CCACGGTCGATACGTCCTGA，即SEQIDNO:4；引物FKYF：ACCTGCGGTTGGATCACC，即SEQIDNO:5；引物YGR：CCATCGTAGTTATCTCTCTA，即SEQIDNO:6；引物FKR：GAAGATGAGTTTTGAGATACA，即SEQIDNO:7；引物ECF：GTCTGCAATTGCCACCACTG，即SEQIDNO:8；引物ECR：AAGTCGCATCCGTTTGTTGC，即SEQIDNO:9；引物23SF：CACGGTGGATGCCYWGGC，即SEQIDNO:10；引物23SR：GTTTGAGATTTTGAGAGACTC，即SEQIDNO:11；引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQIDNO:12；引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQIDNO:13；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的捕获探针包含：探针MCP:GCTTGGTGTGAGACACACC，即SEQIDNO:14；探针HNP：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC，即SEQIDNO:15；探针FLP：TCAGCACTTAAAGCTCTTGAAG，即SEQIDNO:16；探针FKP:AGTGCTCACACAGATTGTCT，即SEQIDNO:17；探针YGP：GCTCAGGTGGTTAGAGCGC，即SEQIDNO:18；探针SAP：TAGCATATCAGAAGGCACACC，即SEQIDNO:19；探针BMP：ATGTATACTTTGTATACGTG，即SEQIDNO:20；探针TLP：GTGTCACGTAAGTGACGCG，即SEQIDNO:21；探针SMYP：TCGCGCAGTAAAGGGTGAT，即SEQIDNO:22；探针LGP：GGAAGCACAATCAAAGAGG，即SEQIDNO:23；探针ECP：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA，即SEQIDNO:24；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的检测膜条上还含有一条用于监控样本核酸提取及扩增的内控探针：ICP：TTTGCTAATCATGTTCATACC，即SEQIDNO:25；优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodT(n)中n为1～30的整数。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述检测引物中的反向引物5’端修饰有生物素标记，所述检测引物与生物素之间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodT(n)中n为1～30的整数。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点的激发波长为200-500nm，所述量子点的发射波长为400-700nm，所述量子点的尺寸为1-200nm。优选的，上述的用于用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述量子点为CdSe/ZnS核壳量子点。优选的，上述的用于11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒中，所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒(将序列SEQIDNO:26进行T克隆进入PGMET载体即可)。所述的肺炎克雷伯菌DNA片段序列为(SEQIDNO:26)：ACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、阳性对照品、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜及偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；所述的荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01N-1.5N的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01N-1.5N盐酸溶液；所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒，所述的阴性对照品包括人基因组DNA；所述的反应液包含以下检测引物：/n引物MCF：GTAGGTTATACCGAAGGTGC，即SEQ ID NO:1；/n引物MCR：ATTCACCGCAAAGTTTACATTC，即SEQ ID NO:2；/n引物TUF：GAAGAATTGCTTGAATTGGT，即SEQ ID NO:3；/n引物TUR：CCACGGTCGATACGTCCTGA，即SEQ ID NO:4；/n引物FKYF：ACCTGCGGTTGGATCACC，即SEQ ID NO:5；/n引物YGR：CCATCGTAGTTATCTCTCTA，即SEQ ID NO:6；/n引物FKR：GAAGATGAGTTTTGAGATACA，即SEQ ID NO:7；/n引物ECF：GTCTGCAATTGCCACCACTG，即SEQ ID NO:8；/n引物ECR：AAGTCGCATCCGTTTGTTGC，即SEQ ID NO:9；/n引物23SF：CACGGTGGATGCCYWGGC，即SEQ ID NO:10；/n引物23SR：GTTTGAGATTTTGAGAGACTC，即SEQ ID NO:11；/n引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQ ID NO:12；/n引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQ ID NO:13。/n...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、阳性对照品、阴性对照品、荧光检测液、变性剂、中性剂及膜条；其中，所述的膜条包括尼龙膜及偶联在尼龙膜上的特异性捕获探针；所述的荧光检测液包括用于标记捕获探针的表面偶联有链霉亲和素的量子点；变性剂包括0.01N-1.5N的氢氧化钠溶液；中性剂包括0.01N-1.5N盐酸溶液；所述的阳性对照品包括肺炎克雷伯菌重组质粒，所述的阴性对照品包括人基因组DNA；所述的反应液包含以下检测引物：
引物MCF：GTAGGTTATACCGAAGGTGC，即SEQIDNO:1；
引物MCR：ATTCACCGCAAAGTTTACATTC，即SEQIDNO:2；
引物TUF：GAAGAATTGCTTGAATTGGT，即SEQIDNO:3；
引物TUR：CCACGGTCGATACGTCCTGA，即SEQIDNO:4；
引物FKYF：ACCTGCGGTTGGATCACC，即SEQIDNO:5；
引物YGR：CCATCGTAGTTATCTCTCTA，即SEQIDNO:6；
引物FKR：GAAGATGAGTTTTGAGATACA，即SEQIDNO:7；
引物ECF：GTCTGCAATTGCCACCACTG，即SEQIDNO:8；
引物ECR：AAGTCGCATCCGTTTGTTGC，即SEQIDNO:9；
引物23SF：CACGGTGGATGCCYWGGC，即SEQIDNO:10；
引物23SR：GTTTGAGATTTTGAGAGACTC，即SEQIDNO:11；
引物ICF：TATGGTTGGGATAAGGCTGG，即SEQIDNO:12；
引物ICR：CGAGCTTAGTGATACTTGTG，即SEQIDNO:13。


2.如权利要求1所述的一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性捕获探针包含：
探针MCP:GCTTGGTGTGAGACACACC，即SEQIDNO:14；
探针HNP：ATTACAGGTCGTGGTACAGTC，即SEQIDNO:15；
探针FLP：TCAGCACTTAAAGCTCTTGAAG，即SEQIDNO:16；
探针FKP:AGTGCTCACACAGATTGTCT，即SEQIDNO:17；
探针YGP：GCTCAGGTGGTTAGAGCGC，即SEQIDNO:18；
探针SAP：TAGCATATCAGAAGGCACACC，即SEQIDNO:19；
探针BMP：ATGTATACTTTGTATACGTG，即SEQIDNO:20；
探针TLP：GTGTCACGTAAGTGACGCG，即SEQIDNO:21；
探针SMYP：TCGCGCAGTAAAGGGTGAT，即SEQIDNO:22；
探针LGP：GGAAGCACAATCAAAGAGG，即SEQIDNO:23；
探针ECP：GGTCATTAGCGCCACTCACTGCA，即SEQIDNO:24。


3.如权利要求2所述的一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的膜条上还含有一条用于同时监控样本核酸提取及扩增的内控探针：
ICP：TTTGCTAATCATGTTCATACC，即SEQIDNO:25。


4.如权利要求2所述的一种同时检测11种下呼吸道病原菌量子点核酸检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针为寡核苷酸单链DNA，所述寡核苷酸单链DNA的3’端或5’端标记有氨基，所述寡核苷酸单链DNA与氨基间连接有间臂，所述间臂为脂肪酸碳链和oligodT(n)中的一种或两种的组合，所述脂肪酸碳链的主链长度为1～12个碳原子，所述oligodT(n)中n为1～30的整数。

【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，裘惠良，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州博芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33