生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法，本发明专利技术的生殖道病原体核酸检测引物，包括：检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑6或SEQ ID No.7‑12所示；检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.13‑14或SEQ ID No.15‑16所示。本发明专利技术的生殖道病原体核酸检测试剂盒，基于量子点和PCR技术，可实现14种生殖道病原体和18种HPV基因分型的同时检测，具有操作简单、价格低廉，可高效、快速、准确地进行32种病原体的检测的优点。

【技术实现步骤摘要】
生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及核酸检测技术，特别涉及一种生殖道病原体核酸检测引物、探针、试剂盒及检测方法。
技术介绍
量子点(Quantumdot，QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，其三维尺寸在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、货架期长等优势，是新一代荧光标记探针的最佳选择。量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、多指标同时检测等应用领域，其优势如下：1)量子荧光效率高，摩尔消光度系数大，其荧光强度比现有最强的有机荧光材料光强强20倍以上，适用于高灵敏度检测，结合高分辨荧光显微镜可实现单量子点示踪；2)具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；3)荧光寿命长，有机荧光染料或生物样本背景荧光寿命一般仅为1-10纳秒，而量子点的荧光寿命可持续10-100纳秒，通过时间分辨特性，可降低背景干扰，提高灵敏度；4)发射波长因组成成分和粒径大小而异，易于制备经表面修饰后特性相似但发射波长不同的量子点；5)宽泛且连续的吸收光谱，实现单一光源多色激发；6)发射光谱窄而对称，可减少多色激发过程中不同量子点之间的干扰；7)量子点具有较大的斯托克斯位移，易与斯托克斯位移较小的有机荧光染料和背景荧光相区分，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度。8)表面修饰后具有更好的生物相容性，与多种生物分子偶联，无非特异吸附。量子点材料在20世纪80年代分别由AlexeyI.Ekimov在玻璃基质中，以及LouisE.Brus在胶体溶液中合成，随后量子点表面配基化学修饰技术逐步完善。由于量子点相对于传统荧光染料具有诸多优点，在1998年Alivisatos和Nie将量子点应用于生物分子标记，使用生物活性分子如抗体或抗原等连接在量子点表面修配体的活性基团上，实现了量子点生物荧光染色，开创了量子点生物标记材料的应用研究。阴道炎是非常常见的一种妇科疾病，居妇女生殖道感染疾病之首。阴道炎的发生、发展是一个多种因素共同作用的结果，生殖道的病原体感染与阴道炎的发生、发展密切相关，生殖道病原体复杂多样，包括细菌、霉菌、滴虫、支原体、衣原体、淋球菌、病毒等。阴道炎根据感染的病原体不同而又分为细菌性阴道病(bacterialvaginosis,BV)、外阴阴道念珠菌病(vulvovaginalcandidiasis,VVC)和滴虫性阴道炎(trichomonalvaginitis,TV)。细菌性阴道病感染的病原菌主要包括需氧菌(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌)和厌氧菌(阴道加德纳菌、阴道阿托波尔菌、动弯杆菌)；外阴阴道念珠菌病曾称为霉菌性阴道炎、外阴阴道假丝酵母菌病等，是由念珠菌引起的女性生殖道感染性疾病，其病原菌是以白念珠菌为主的酵母菌，其他如光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等非白念珠菌占少数；滴虫性阴道炎感染的病原菌是阴道毛滴虫。健康女性阴道菌群由各种需氧茵和厌氧菌组成，各种微生物之间的相互制约、相互作用、相互依赖以及阴道局部的免疫状态，使阴道内微生物群与宿主、环境保持着协调、动态的平衡。在受到内源性和外源性因素影响时(如性激素的变化、抗生素的广泛使用、不当的阴道灌洗、全身性免疫低下性疾病、性交、避孕药具等)，阴道菌群的动态平衡容易被打破，导致阴道菌群失衡，作为优势菌的乳杆菌将被抑制或大量减少，对其他微生物的抑制作用会减弱，引起病源微生物大量增殖，成为异常优势菌，从而会导致生殖道感染的发生，引发阴道炎等。性传播疾病(sexuallytransmitteddiseases，STD)顾名思义就是一种经性途径而引起的传染性疾病的总称。能引起性传播疾病的病原体有淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体、人型支原体、生殖支原体、解脲脲原体、乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体等二十多种。人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的1、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。在1995年，世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)发布了有关高危型HPV是宫颈癌必要的致病因子以后，HPV感染受到全球的广泛关注。对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类，将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变的发生相关，尤其是HPVl6和18型；26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别。目前临床常用的生殖道感染病原体检测方法有很多，比如镜检、培养、抗原抗体检测的免疫学方法、DNA杂交、PCR等，上述检测方法均不具有高通量的特点，不能满足在一份样品中检测多重感染的情况，使不少患者存在漏检问题。因此，临床上急需一种简单、快捷、经济和高通量的检测技术。根据BV、VVC等的诊治规范草案和文献资料筛选出14种需检测的生殖道病原体如表1；依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，18种需检测的HPV型别如表2。表1表213种高危型别HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、685种中等风险型别HPV26、53、66、73、82目前，国内市面上虽然已经存在相关核酸检测产品(三种泌尿生殖道感染病原物的联合检测基因芯片试剂盒，生产厂家为昆明云大生化科技有限责任公司、性传播疾病监测试剂盒，生产厂家为四川大学华西医院、泌尿生殖道支原体分型检测试剂盒，生产厂家为广东凯普生物科技股份有限公司、解脲脲原体核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)，生产厂家为上海仁度生物科技有限公司、37种HPV分型检测试剂盒，生产厂家广东凯普生物科技股份有限公司等)，但是暂无生殖道感染病原体和HPV基因分型同时检测的产品。通过网上查询和市场调研可知，市场上相关产品均不能实现生殖道病原体和HPV基因分型共32种病原体的同时检测，临床上不能全面准确的检测病原体，会给临床指导造成困扰。技术方面，目前，用于检测生殖道病原体和HPV基因分型的的方法主要有：PCR-荧光探针法和基因芯片(PCR-反向点杂交)。PCR-荧光探针法，该方法操作简便，可检测变异发生率低于10％的耐药变异。由于受到荧光报告基团及仪器检测通道的限制，1管PCRmix可检测的突变类型有限，需多管PCRmix才能满足如此多突变类型的检测，成本高。通过网上查询和市场调研可知，市场上相关产品均不能实现生殖道病原体和HPV基因分型共32种病原体的同时检测，临床上不能全面准确的检测病原体，会给临床指导造成困扰。发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生殖道病原体核酸检测引物，其特征在于，所述引物包括：检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1‑6和/或SEQ ID No.7‑12所示；检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.13‑14和/或SEQ ID No.15‑16所示。

【技术特征摘要】
1.一种生殖道病原体核酸检测引物，其特征在于，所述引物包括：检测生殖道病原体的引物，其核苷酸序列如SEQIDNo.1-6和/或SEQIDNo.7-12所示；检测HPV分型的引物，其核苷酸序列如SEQIDNo.13-14和/或SEQIDNo.15-16所示。2.根据权利要求1所述的生殖道病原体核酸检测引物，其特征在于，所述引物还包括：内控引物，其核苷酸序列如SEQIDNo.17-18和/或SEQIDNo.19-20所示。3.一种生殖道病原体核酸检测探针，其特征在于，所述探针包括：检测生殖道病原体的探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.21-34所示；检测HPV分型的探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.35-52所示。4.根据权利要求1所述的生殖道病原体核酸检测探针，其特征在于，所述探针还包括：内控探针，其核苷酸序列如SEQIDNo.53所示。5.根据权利要求1所述的生殖道病原体核酸检测探针，其特征在于，所述探针的5’端进行氨基修饰。6.一种生殖道病原体核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括权利要求1-2任意一项所述的生殖道病原体核酸检测引物以及权利要求3-5任意一项所述的生殖道病原体核酸检测探针。7.根据权利要求6所述的生殖道病原体核酸检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括第一PCR反应液和第二PCR反应液，所述第一PCR反应液包括核苷酸序列如SEQIDNo.1-6所示的检测生殖道病原体的引物以及核苷酸序列如SEQIDNo.17-18所示的内控...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，裘惠良，郑银娜，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州博芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33