一种HBV DNA定量检测方法技术

本申请公开一种HBV DNA定量检测方法，包括：步骤一：样本处理；步骤二：准备反应管；步骤三：在反应管上做好标记，分别加已提取的待测样品、阴性质控品、缺失质控品，低速离心数秒；步骤四：对步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：放入43℃水浴摇床或杂交箱杂交1.5小时至4小时；然后取玻璃瓶并加入0.5×SSC液，拧紧盖子，一并置于43℃水浴摇床或杂交箱中预热；用A液室温轻摇洗膜；再用C液室温轻摇洗膜，同时配制显色液；将膜条浸泡于显色液中显色10‑15分钟即可观察并并根据膜条上的杂交斑点判断突变位点；具有适应性广和特异性高的优点；检测灵敏度更高、特异性及准确性更好。

【技术实现步骤摘要】
一种HBVDNA定量检测方法
本专利技术属于基因检测领域，具体是指一种HBVDNA定量检测方法。
技术介绍
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种疾病，主要通过血和血制品、母婴传播及性接触传播。乙型肝炎病毒感染者临床表现多样化，潜伏期较长，最常见的临床表现有食欲减退、恶心、呕吐、腹胀、乏力等症状，部分患者有低热等症状。乙型肝炎患者可发展为慢性肝炎，导致肝硬化或肝癌。HBV-DNA常规检测方法主要有斑点杂交法和荧光定量PCR法。斑点杂交法是较传统的方法，成本较低，灵敏度以及精准度都较低，假阳性几率较高，不适合做HBV定量检测。荧光定量PCR法是一种集PCR技术、荧光信号检测和数据分析于一体的核酸定量检测技术。荧光定量PCR使用了特异性的探针，能够对靶序列进行特异性的识别，具有引物探针双重控制，且综合了荧光标记技术、激光检测技术、数码显像技术，在扩增指数期进行定量，具有很高的特异性、灵敏性，准确性及假阳性率低等特点。国内外临床应用HBV-DNA荧光定量PCR法存在以下缺陷：1.常用的核酸提取方法有：a、磁珠法；b、层析柱法；c、碱裂解法,以上三种方法需要繁琐的离心、换管等步骤，易导致核酸污染与丢失，且操作过程繁杂，操作人员易疲劳操作。2.PCR反应体系：传统的PCR反应体系多为无色，容易导致视觉疲劳。因此，如何研发一种HBVDNA定量检测方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本申请解决的主要问题是提供一种HBVDNA定量检测方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，敏感性高、特异性很好、反应快速、成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展，从而实现对HBV病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。以解决一种HBVDNA定量检测方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作等技术问题。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种HBVDNA定量检测方法，其技术方案如下：一种HBVDNA定量检测方法，其特征在于，包括：步骤一：相关试剂配制；步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离心时注意固定离心管方向，吸弃上清，13000rpm离心3min,取出震荡混匀后再13000rpm离心5min,保留上清备用；步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：结果分析与判断。进一步的，所述步骤五中结果分析包括：基线的确定:取4～10个循环的荧光信号，可需根据当日结果曲线调整基线；阈阅值设定:为刚好超过正常阴性对照扩增曲线；阈值的设定必须在指数增长期；应选在标准曲线间隔均匀处。进一步的，所述步骤五中结果判断包括：检测样本中5.00E+02IU/ml≤HBVDNA<2.72E+08IU/ml,测定结果有效,直接报告相应的拷贝定性检测报告阳性；若检测样本中HBVDNA≥2.72E+08IU/m1,需用正常人血清301倍稀释,使其拷贝数范围落在104～107IU/m1范围内再重新测定,报告结果时应在测得结果基础上乘以301,并填写《超出线性范围的样本复查记录》，如为定性检测直接报为阳性；检测样本HBVDNA<5.00E+02IU/m1时,报告为<5.00E+02IU/m1，定性检测时报告阴性；Ct值无数值时,报告为<5.00E+02IU/ml，定性检测报告阴性。进一步的，将反应管瞬时离心后放入ABI7300荧光定量PCR仪中，在SDS软件中编号,编号应与PRD系统接收标本时生成的实验号一致，并设好各工作标准品参数，将报告荧光设定为FAM,淬灭荧光设为none,参比荧光设定为none。进一步的，所述步骤四的PCR扩增的循环次数为36-45次，循环条件为：50℃、2min；94℃、2min；94℃、10sec；60℃、30sec；35℃、10sec。进一步的，所述步骤一包括：从试剂盒中取出PCR反应液,室温融化后，约1小时，漩涡混匀,2000rpm离心数秒；计算所需要分装的管数n，n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高值质控品+1管低值质控品+6阳性参控品，向n个PCR反应管中分别加入28ulPCR反应液,转移至样本处理区。本专利技术操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，敏感性高、特异性很好、反应快速、成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展，从而实现对HBV病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。具体实施方式如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。实施例一：一种HBVDNA定量检测方法，其特征在于，包括：步骤一：相关试剂配制；步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离心时注意固定离心管方向，吸弃上清，沉淀不明显,需在离心管底部沉淀对侧吸上清,尽可能吸弃上清且不碰沉淀，13000rpm离心3min,取出震荡混匀后再13000rpm离心5min,保留上清备用；步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：结果分析与判断。所述步骤五中结果分析包括：基线的确定:取4～10个循环的荧光信号，可需根据当日结果曲线调整基线；阈阅值设定:为刚好超过正常阴性对照扩增曲线；阈值的设定必须在指数增长期；应选在标准曲线间隔均匀处。所述步骤五中结果判断包括：检测样本中5.00E+02IU/ml≤HBVDNA<2.72E+08IU/ml,测定结果有效,直接报告相应的拷贝定性检测报告阳性；若检测样本中HBVDNA≥2.72E+08IU/m1,需用正常人血清301倍稀释,使其拷贝数范围落在104～107IU/m1范围内再重新测定,报告结果时应在测得结果基础上乘以301,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV DNA定量检测方法，其特征在于，包括：步骤一：相关试剂配制；步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离心时注意固定离心管方向，吸弃上清，13000r pm离心3min,取出震荡混匀后再13000r pm离心5min,保留上清备用；步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在‑20℃,使用前置室温解冻,以13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：结果分析与判断。

【技术特征摘要】
1.一种HBVDNA定量检测方法，其特征在于，包括：步骤一：相关试剂配制；步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离心时注意固定离心管方向，吸弃上清，13000rpm离心3min,取出震荡混匀后再13000rpm离心5min,保留上清备用；步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；步骤五：结果分析与判断。2.根据权利要求1所述的HBVDNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤五中结果分析包括：基线的确定:取4～10个循环的荧光信号，可需根据当日结果曲线调整基线；阈阅值设定:为刚好超过正常阴性对照扩增曲线；阈值的设定必须在指数增长期；应选在标准曲线间隔均匀处。3.根据权利要求2所述的HBVDNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤五中结果判断包括：检测样本中5.00E+02IU/ml≤HBVDNA<2.72E+08IU/ml,测定结果有效,直接报告相应的拷贝定性检测报告阳性；若检测样本中H...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐笑，田倩，何媛，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43