一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒的试剂盒及其检测方法技术

一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒CMV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性CMV抗体IgG、特异性RT反向引物CMV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；特异性LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为兰州百合CMV CP基因标准品；本发明专利技术不用提取RNA，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，特异性和灵敏度高，操作简便，适用性强，可用于监控百合CMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

A specific kit for detection of Lily cucumber mosaic virus and its detection method

An IC_RT_LAMP kit for the specific detection of CMV of lily-cucumber mosaic virus and its detection method were developed. The kit mainly included specific CMV antibody IgG, specific RT reverse primer CMV_R, specific LAMP primer group, first-strand cDNA synthesis reagent, LAMP amplification reaction reagent, fluorescent dye detection fluid, negative control substance and positive. Specific LAMP primer group was composed of forward-outward primer F3, reverse-outward primer B3, forward-inward primer FIP, reverse-inward primer BIP, forward-loop primer LF and reverse-loop primer LB; negative reference was ddH2O, and positive reference was CMV CP gene standard of Lilium lanzhou; the invention did not need to extract RNA, enzyme marker and PCR. Molecular biology instruments, such as fluorescence quantitative PCR, can be used to monitor the occurrence, spread and epidemic of CMV in lily, which is suitable for popularization and application at grass-roots level.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒的试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒CMV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。
技术介绍
百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，其中黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是发生最普遍的病毒之一，以兰州食用百合为例，最新的病毒病田间调查结果显示，CMV感染率达到42.5%（Zhangetal.,2018），病毒病造成百合种源严重退化，已成为制约百合产业发展的重要因素。CMV是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员，在世界范围内均有分布，宿主范围遍布于双子叶植物和单子叶植物，已经阐明的就多达1000种以上；CMV病毒颗粒分子量在5000～67000kDa之间，病毒体RNA含量占18%，蛋白质含量82%，衣壳蛋白分子量为24.5KDa；A260/A280大约1.7；病毒颗粒为正20面体球状，直径28～30nm；RNA由四条RNA分子组成，RNA1和RNA2被分别包被，RNA3和RNA4则被包被于同一衣壳中。防治百合病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此CMV的检测对于百合病毒病的防治具有重要的意义。目前，针对百合CMV的常用检测技术主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫捕获(IC)-RT-PCR和实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法等。ELISA方法易污染，且交叉反应比较严重，假阳性多，灵敏性偏低；RT-PCR和Real-timePCR方法检测灵敏度高，但是上述方法操作复杂，对检测人员的技术要求高，还必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留的多酚和多糖会严重影响检测的灵敏度和特异性；IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR另种方法的优点，不用提取RNA，但其灵敏度仍有待提高；除此之外，上述方法都必须依赖酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备才能完成检测。DNA环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofDNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成茎环结构和多环花椰菜样结构DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。由于现有百合病毒检测技术都必须依赖于专业仪器设备和专业技术人员，因而在适用性上有很大的局限性，本专利技术将免疫捕获与LAMP技术有机结合，成功建立了IC-RT-LAMP技术特异检测百合黄瓜花叶病毒的方法。IC-RT-LAMP结合了血清学和LAMP两种方法的优点，特异性好、灵敏度高、操作简便、在恒温水浴中即能完成扩增反应，比如可以是恒温水浴锅、水浴盆、水浴器等等，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器，更重要的是不用提取RNA，检测成本低，不受多糖多酚的影响，检测结果可用肉眼直接观测，非常适合百合、水仙、郁金香种球以及鳞茎的病毒检测，为LSV病毒的高效防治提供可靠的技术依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有百合CMV病毒检测方法中技术要求高且依赖专业仪器设备的缺陷与不足，提供一种无需分子生物学专业仪器设备即能特异性高效检测百合黄瓜花叶病毒的IC-RT-LAMP方法；具体是将免疫学与LAMP技术巧妙地结合,首先将CMV病毒的特异性抗体包被在包被容器壁上用于特异性捕获检测样品中的CMV粒子，起到浓缩和纯化病毒的作用，再以捕获的CMV粒子为模板进行反转录RT反应再进行LAMP反应，即达到检测百合黄瓜花叶病毒的目的。该方法可以特异性地检测百合植株、种球、试管苗或组培苗中的CMV，尤其适用于富含多糖多酚的百合种球以及鳞茎的病毒检测，检测过程不用提取RNA，操作简便，在恒温水浴中即能完成扩增反应，无需酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等专业的仪器设备，适用性强，与其他现有技术相比具有明显的优势。本专利技术的目的是提供一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒的IC-RT-LAMP试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种利用IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测百合黄瓜花叶病毒的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种特异性检测百合CMV病毒的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性CMV抗体IgG、特异性RT反向引物CMV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，其中特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，上述特异性RT反向引物CMV-R以及LAMP引物组的序列如下：CMV-R：5’-CACTCCGGACGTGGGAATAC-3’；F3：5’-GCCTCACCGGTACTGGTT-3’；B3：5’-GACGTGGGAATACGTTGGT-3’；FIP：5’-CCTATATCAGCGCGCATCGCCATCAGTACGCTGCATCTGGA-3’；BIP：5’-TGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGCTCGACGTCAACATGAAGT-3’；LF：5’-CAACAGTTTGTTGTTAGCTTGGAC-3’；LB：5’-GTATTCAAAAGACGATGCACTCGA-3’。本专利技术的关键在于LAMP扩增引物的设计；本专利技术设计的LAMP引物组，通过6条特异性引物，即正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向内引物（FIP）、反向内引物（BIP）、正向环引物（LF）和反向环引物(LB)来识别靶基因（百合CMVCP）的8个特异序列，即位于靶标基因5'端的F1、F2和F3区、3'端的B1c、B2c和B3c区以及LF和LB区的序列。引物的位置均有严格的顺序性，8个不同位点完全匹配才能进行扩增，保证了LAMP扩增的高效性和特异性。除此之外，所述第一链cDNA合成试剂由10mMdNTPs、5×M-MLV反应缓冲液、30U/μLRNase抑制剂、200U/μLM-MLV反转录酶和DEPC-H2O组成；所述LAMP扩增反应试剂由10mMdNTPs、10×Thermpopol反应缓冲液、100mMMgSO4、8U/μLBstDNApolymerase和ddH2O组成。为了达到检测的要求，本专利技术的试剂盒还包括抗体包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒CMV的IC‑RT‑LAMP试剂盒，包括特异性CMV抗体IgG、特异性RT反向引物CMV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，所述特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，所述特异性RT反向引物CMV‑R以及LAMP引物组的序列如下：CMV‑R：5’‑ CACTCCGGACGTGGGAATAC ‑3’F3：5’‑GCCTCACCGGTACTGGTT‑3’B3：5’‑ GACGTGGGAATACGTTGGT ‑3’FIP：5’‑ CCTATATCAGCGCGCATCGCCATCAGTACGCTGCATCTGGA ‑3’BIP：5’‑TGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGCTCGACGTCAACATGAAGT‑3’LF：5’‑ CAACAGTTTGTTGTTAGCTTGGAC ‑3’LB：5’‑ GTATTCAAAAGACGATGCACTCGA ‑3’其特征在于：所述试剂盒还包括CMV抗体IgG 包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为兰州百合CMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：兰州百合CMV CP基因标准品：TTCCTGCCTCCTCGGACTTATCCGTTGCCGCCATCTCTGCTATGTTTGCGAACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTATCAGTACGCTGCATCTGGAGTCCAAGCTAACAACAAACTGTTGTATGATCTTTCGGCGATGCGCGCTGATATAGGCGACATGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCACTCGAGACAGACGAGTTAGTACTTCATGTTGACGTCGAGCACCAACGTATTCCCACGTCCGGAGTG。...

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒CMV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性CMV抗体IgG、特异性RT反向引物CMV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，所述特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，所述特异性RT反向引物CMV-R以及LAMP引物组的序列如下：CMV-R：5’-CACTCCGGACGTGGGAATAC-3’F3：5’-GCCTCACCGGTACTGGTT-3’B3：5’-GACGTGGGAATACGTTGGT-3’FIP：5’-CCTATATCAGCGCGCATCGCCATCAGTACGCTGCATCTGGA-3’BIP：5’-TGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGCTCGACGTCAACATGAAGT-3’LF：5’-CAACAGTTTGTTGTTAGCTTGGAC-3’LB：5’-GTATTCAAAAGACGATGCACTCGA-3’其特征在于：所述试剂盒还包括CMV抗体IgG包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBRGreenI荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为ddH2O；所述阳性对照品为兰州百合CMVCP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：兰州百合CMVCP基因标准品：TTCCTGCCTCCTCGGACTTATCCGTTGCCGCCATCTCTGCTATGTTTGCGAACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTATCAGTACGCTGCATCTGGAGTCCAAGCTAACAACAAACTGTTGTATGATCTTTCGGCGATGCGCGCTGATATAGGCGACATGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCACTCGAGACAGACGAGTTAGTACTTCATGTTGACGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王亚军，谢忠奎，王若愚，郭志鸿，邱阳，何玉惠，
申请(专利权)人：中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62