甲型流感病毒全基因组通用扩增方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法PIFAWGA，本发明专利技术通过使用接力半特异扩增策略，提高病毒全基因组扩增效率。该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。经检测实验结果显示，本方法能稳定有效的扩增甲流病毒基因组，适用的病毒核酸样本最低原始浓度为104 copies/ml，本方法能获得更多的流感病毒全长基因扩增产物，而且产物长度均一化好，减少了后期二代测序DNA建库过程中样本损耗，有利于其达到二代测序对样本DNA起始量的要求，适用于低病毒拷贝临床标本。

Universal amplification method for influenza A virus genome

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to a universal amplification method PIFAWGA for the whole genome of influenza A virus. This method can be used for enrichment of influenza virus nucleic acid in low viral copy clinical samples to meet the target nucleic acid start-up requirement of the second generation sequencing. The results showed that this method could amplify the genome of influenza A virus stably and effectively. The lowest original concentration of nucleic acid sample was 104 copies/ml. More full-length amplified products of influenza virus could be obtained by this method, and the length of the products was uniform, which reduced the sample size in the process of constructing the second-generation sequencing DNA library. This loss is helpful to meet the requirement of second-generation sequencing for the initial amount of sample DNA, and is suitable for low-viral copy of clinical specimens.

【技术实现步骤摘要】
甲型流感病毒全基因组通用扩增方法
本专利技术属生物
，具体涉及一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（Pan-influenzaAwhole-genomeAmplificationassay,PIFAWGA），本专利技术通过使用接力半特异扩增策略，提高病毒全基因组扩增效率。该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。
技术介绍
现有技术公开了流感病毒（influenzavirus，IV）是全球主要传染病原之一，不仅能感染家禽（avianflu）和猪（swineflu）等重要家畜，还可引起人类散发性季节流感（seasonalflu）,地区性流行（epidemic）以及全球大流行(pandemic)。因此，流感病毒的病原学诊断对我国传染病防控至关重要，开发相应的快速诊断分型试剂具有重大的社会和经济意义。研究显示了流感病毒属于正黏液病毒科（orthomyxoviridae）,是RNA负链病毒，基因组由8个单链RNA节段(PB2,PB1,PA,HA,NP,NA,M和NS)组成，分别编码11个病毒蛋白（HA,NA,NP,M1,M2,NS1,NS2,PA,PB1,PB1-F2和PB2）。流感病毒可利用基因组重配（reassortment）机制使基因序列突然发生重大变异，引起病毒蛋白抗原性的剧烈改变，导致免疫暴露（naïve）人群中流感爆发。根据M蛋白抗原性，流感病毒可分为3个种（species）：甲，乙，丙（A，B，C）。血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）是病毒主要表面抗原蛋白，目前已知甲型流感病毒有18种HA血清型和11种NA血清型，病毒株的命名根据HA和NA亚型以及毒株分离时间和地点确定。研究报道，目前已知的16种HA血清型,能在禽类中全部检测到，其中H5N1，H7N7和H7N9为高致病性禽流感；在人类中已检测到的有H1,H2,H3,H5,H7和H9亚型，其中H1和H3（和流感B）引起人季节流感。此外，2013年新发现的人感染H7N9和H10N8病例说明新型重组流感仍源源不断出现并且可能感染到人，以致威胁公众安全。因此，业内公认，对流感病毒的分子诊断应当能鉴别高／低致病性禽流感，人季节性流感和猪流感，特别是未知新型流感。目前市场上流感病毒诊断分型试剂盒以荧光定量PCR方法为主流技术，实践显示其检测特异性高，成本低，操作方便，但是，该类试剂盒是根据已知流感病毒序列设计特异性引物和探针，因此，只能鉴别已知常见流感亚型，尚不能鉴定未知新型病毒；此外，由于频发的流感基因序列突变常导致引物和探针扩增失败，检测敏感性降低，因此，需要定期更新引物和探针，重新进行试剂评估，导致此类试剂盒的研发维护成本高，而且市场接受度不高，因此，本领域需要能鉴定已知和未知新型流感的流感病毒诊断分型试剂盒。近年，二代测序技术应用于病毒的分子快速诊断，包括Roche公司的454FLX/GS测序平台、ThermoFisher公司的IonTorrentPGM平台和Illumina公司Hiseq/Miseq测序平台，其中，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，比原有Sanger测序法（一代测序）具有高通量、高敏感性，更适用于全基因组重测序，特别是对低病毒拷贝的临床标本进行检测，并且可以发现样本中低拷贝数量的（新）变异毒株的存在。ThermoFisher公司推出基于IonTorrent平台的商业化PathAmpTMFluA流感病毒全基因组扩增试剂盒，该方法采用8对针对8段基因的特异性引物混合物，对样本进行多重PCR扩增，但是实践应用证实该试剂盒对培养毒株（病毒载量在106RNAcopies/ml以上）检测效果较好，但是对临床标本检测敏感性较低，而且随着流感病毒序列的不断变异，该方法的敏感性也随之下降，因此，低病毒拷贝临床标本的流感病毒测序是本领域存在的一个共同的技术难点。基于现有技术的现状，尤其针对低病毒拷贝临床标本技术难点，本申请的专利技术人拟提供一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（Pan-influenzaAwhole-genomeAmplificationassay,PIFAWGA），该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。与本专利技术相关的现有技术有：1.ZhouB,DonnellyME,ScholesDT,StGeorgeK,HattaM,KawaokaY,WentworthDE.Single-reactiongenomicamplificationacceleratessequencingandvaccineproductionforclassicalandSwineoriginhumaninfluenzaaviruses.JVirol.2009Oct;83(19):10309-13.2.HuY,LuS,SongZ,WangW,HaoP,LiJ,etal.AssociationbetweenadverseclinicaloutcomeinhumandiseasecausedbynovelinfluenzaAH7N9virusandsustainedviralsheddingandemergenceofantiviralresistance.Lancet.2013;381(9885):2273-9.3.WHO:CDCprotocolofreal-timeRT-PCRforinfluenzaA(H1N1),30April2009。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术中低病毒拷贝临床标本技术难点，提供一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法（Pan-influenzaAwhole-genomeAmplificationassay,PIFAWGA），该方法可用于低病毒拷贝临床样本中流感病毒核酸富集，使其达到二代测序所要求目标核酸启始量要求。本专利技术方法中，采用病毒接力式半特异性扩增策略，包括一级甲型流感病毒通用扩增引物和二级随机引物，提高病毒全基因组扩增效率，建立甲型流感病毒全基因组扩增方法，该方法可用于富集临床标本中病毒核酸，使其达到二代测序对样本DNA起始量的要求（通常在100ng以上）。更具体的，本专利技术公开了一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法，其中采用病毒接力式半特异性PCR扩增策略，包括步骤：1）第一级RT-PCR扩增反应，采用一对甲型流感病毒特异性引物，该对引物3’端12或13个碱基分别针对全部病毒8节段基因的两端Uni-12或Uni-13序列，该两部分序列已经被证实不仅在8段基因之间高度保守，而且在所有甲型流感病毒亚型之间也高度保守；所述引物5’端则包含设计的标签序列碱基；本轮引物的扩增其目的是从临床标本中得到流感病毒8节段基因组全长；2）第二级PCR扩增反应，采用半随机引物，该条引物包括3’端6个随机碱基和5’端与一级流感引物标签序列互补的9个碱基，其目的是将一级扩增中得到的带标签序列的流感病毒基因组全长片段二次扩增，从而达到将标本中病毒核酸最大化扩增富集的效果。本专利技术的实施例中，采用两轮扩增策略，对流感病毒8段基因组进行全长扩增和富集；检测体系包括两组引物,第一组本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法，其特征在于，采用病毒接力式半特异性扩增策略，包括一级甲型流感病毒通用扩增引物和二级随机引物，提高病毒全基因组扩增效率，包括步骤：1）第一级RT‑PCR扩增反应，采用一对甲型流感病毒特异性引物，该对引物3’端12或13个碱基分别针对全部病毒8节段基因的两端Uni‑12或Uni‑13序列，2）第二级PCR扩增反应，采用半随机引物，该条引物包括3’端6个随机碱基和5’端与一级流感引物标签序列互补的9个碱基。

【技术特征摘要】
1.一种甲型流感病毒全基因组通用扩增方法，其特征在于，采用病毒接力式半特异性扩增策略，包括一级甲型流感病毒通用扩增引物和二级随机引物，提高病毒全基因组扩增效率，包括步骤：1）第一级RT-PCR扩增反应，采用一对甲型流感病毒特异性引物，该对引物3’端12或13个碱基分别针对全部病毒8节段基因的两端Uni-12或Uni-13序列，2）第二级PCR扩增反应，采用半随机引物，该条引物包括3’端6个随机碱基和5’端与一级流感引物标签序列互补的9个碱基。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用两轮扩增策略，对流感病毒8段基因组进行全长扩增和富集；检测体系包括两组引物,第一组引物为one-stepRT-PCR甲型流感通用全基因组引物P1-F和P1-R，第二组PCR引物为半随机引物P2-FR；所采用的引物和探针序列如下表所示：引物名称序列5'-->3'P1-FCAGGATCAGCAAAAGCAGGP1-RCAGGATCAGTAGAAACAAGGP2-FRCAGGATCAGNNNNNN。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蔚，胡芸文，袁正宏，刘祎，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：上海,31