本发明专利技术属于禽类病毒检测技术领域，本发明专利技术公开了一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT‑PCR检测引物组、试剂盒及其应用。发明专利技术人通过设计针对H9与H10亚型AIV HA基因的特异性引物，经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果最佳的一个引物组合，然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性和敏感性试验表明该方法只能扩增出H9与H10亚型AIV HA基因，不能检测出其它亚型AIV及常见家禽病原的核酸，最低能检测到量为5×104拷贝/μL质粒模板，另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符。
Identification of double RT-PCR detection primers and kits for H9 and H10 subtype avian influenza viruses and their applications
The invention belongs to the field of avian virus detection technology. The invention discloses a duplex RT_PCR detection primer group, kit and application for simultaneous identification of H9 and H10 subtypes of avian influenza virus. By designing specific primers for H9 and H10 subtypes of AIV HA gene, the inventor obtained the best combination of primers through screening different primer combinations, and then continued to optimize the primer concentration, annealing temperature and amplification time, and finally established a method for simultaneous detection of H9 and H10 subtypes of AIV. The specificity and sensitivity test showed that the method could only amplify the H9 and H10 subtypes of AIV HA gene, and could not detect other subtypes of AIV and common poultry pathogens. The minimum detectable amount was 5 104 copies/muL plasmid template. The results of clinical samples also showed that it was completely consistent with the results of virus isolation.
【技术实现步骤摘要】
同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用
本专利技术属于禽类病毒检测
，尤其涉及一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒属成员。根据其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)的差异可以将AIV划分为16种不同的HA亚型(H1-H16)和9种不同的NA亚型(N1-N9)。H9亚型AIV自1966年在美国首次被发现，目前已经给全球养禽业造成了十分严重的经济损失。自1998年广东首次发现人感染H9N2亚型AIV病例以来，H9N2型AIV感染人事件也在不断的发生。H10亚型AIV主要在北美地区的鸡、火鸡、野鸟及南非地区的鸭中分离到病毒，近年来在我国华南地区的环境及家禽拭子样品中也有分离到H10亚型禽流感毒株的报道。在之前的2004年和2010年，埃及和澳大利亚分别出现H10亚型AIV感染人事件。自2013年12月以来，中国先后发生3例人感染H10N8亚型禽流感病毒的病例并造成其中2例死亡，这是世界上首次报道H10亚型流感病毒感染人并致死的病例。近年来的低致病性禽流感的流行病学的监测中发现H9和H10亚型禽流感病毒混合感染普遍存在，研究还表明感染人的H10N8亚型流感病毒的部分内部基因来源于H9N2亚型AIV。因此，H9与H10亚型AIV对家禽养殖及人类健康卫生具有重要意义。由于经典的病毒分离鉴定方法存在检测鉴定周期较长的缺点，而常用的血清学方法则需要较多标准阳性血清且不同亚型血清之间存在不同程度的交叉反应，具有一定的局限性，所以目前检测禽流感病毒主要是采用分子生物学方法。分子生物学特别是PCR检测方法具有操作简便、特异性好、敏感性高等优点，在禽流感病毒的监测和诊断过程中得到了广泛的应用。由于AIV混合感染普遍存在且具有相似的临床症状，难以及时准确的对其进行鉴别区分。近年来多重PCR技术在禽流感诊断中的应用越来越多，但关于H9与H10亚型AIV混合感染的多重PCR检测方法还见报道。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组、试剂盒及其应用，建立一种可同时检测H9与H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法，不仅可以快速准确的鉴别两种不同亚型AIV，也为感染人的AIV病原学监测提供技术支撑，具有十分重要的公共卫生意义。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组，包括2对特异性引物，分别是引物对H9-F和H9-R、引物对H10-F和H10-R，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的序列。一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：2×PCRMix12.5μL，H9与H10亚型AIV共2μL作为模板，特异性引物H9-F和H9-R的加入量为0.75μL，特异性引物H10-F及H10-R的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。作为优选，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的序列。作为优选，所述的特异性引物H9-F和H9-R、特异性引物H10-F和H10-R在PCR反应体系中对应的的摩尔终浓度分别为0.75pmol/μL、0.75pmol/μL、1pmol/μL、1pmol/μL。本专利技术还提供了所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组或所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒在鉴别H9和H10亚型禽流感病毒中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过设计针对H9与H10亚型AIVHA基因的特异性引物，经过对不同引物组合的筛选得到扩增效果的一个引物组合，然后继续对其引物浓度、退火温度和扩增时间进行优化，最终建立起可同时检测H9与H10亚型AIV的方法。其特异性和敏感性试验表明该方法只能扩增出H9与H10亚型AIVHA基因，不能检测出其它亚型AIV及常见家禽病原的核酸，最低能检测到量为5×104拷贝/μL质粒模板，另外临床样品的检测结果也表明其与病毒分离结果完全相符。(2)本专利技术成功建立了能同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法，该方法具有特异性强及灵敏度高、方便和快速等优点，一次PCR反应便可确定H9与H10亚型AIV的混合感染及单一感染情况，方便基层单位应用，为H9与H10亚型AIV的快速鉴别诊断提供有效的技术支撑。附图说明图1为本专利技术的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法的特异性试验结果图；其中，M.DNAMarkerDL1000；1.H9+H10；2.H9+H10；3.H9N2；4.H9N6；5.H10N2；6.H6N6；7.H1N7；8.H2N3；9.H3N2；10.H5N2；11.H7N9；12.H8N4；13.H10N3；14.H12N5；15.H13N5；16.H14N1；17.H15N5；18.NDV；19.IBV；20.ARV；21.ILTV；22.MG；23.Negativecontrol；图2为本专利技术的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法的敏感性试验结果图；其中，M为DNAMarkerDL1000；1为5×109copies/μL；2为5×108copies/μL；3为5×107copies/μL；4为5×106copies/μL；5为5×105copies/μL；6为5×104copies/μL；7为5×103copies/μL；8为5×102copies/μL；9为5×101copies/μL；10为10copies/μL；11为Negativecontrol；图3为本专利技术的同时检测H9与H10亚型AIV二重RT-PCR方法对临床样品试验结果图；其中，M.DNAMarkerDL1000；7、10、14and16.PositiveproductsofH9subtypeAIVs；2.PositiveproductsofH9andH10subtypeAIVs；Theotherswerenegativeproducts。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此外，在阅读本专利技术的内容后，本领域的技术人员可以对本专利技术作各种修改，这些等价变化同样落于本专利技术所附权利要求书所限定的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的禽流感毒株及其他禽类病毒参考株均由广西壮族自治区兽医研究所保存。实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT‑PCR检测引物组，其特征在于，包括2对特异性引物，分别是引物对H9‑F和H9‑R、引物对H10‑F和H10‑R，其分别具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.4所示的序列。
【技术特征摘要】
1.一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测引物组，其特征在于，包括2对特异性引物，分别是引物对H9-F和H9-R、引物对H10-F和H10-R，其分别具有如SEQIDNo.1至SEQIDNo.4所示的序列。2.一种同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括：2×PCRMix12.5μL，H9与H10亚型AIV共2μL作为模板，特异性引物H9-F和H9-R的加入量为0.75μL，特异性引物H10-F及H10-R的加入量为1μL，用RNA-free水补足至终体积至25μL。3.根据权利要求2所述的同时鉴别H9和H10亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，李政庭，李丹，李孟，谢志勤，罗思思，谢丽基，邓显文，黄娇玲，范晴，张艳芳，曾婷婷，王盛，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西,45
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