本发明专利技术涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒及其应用。所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为包括经典型和/或高致病型和/或NADC30‑like型毒株；所述试剂盒包括上游引物和下游引物。本发明专利技术提供的试剂盒快捷、经济，经过一次PCR反应即可区分经典型、高致病型和NADC30‑like型毒株，在上述三种毒株鉴别检测用方面具有操作简便、成本低的优势和实用价值。
* a kit for differential diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its application
The invention relates to a kit for * differential diagnosis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its application. * the porcine reproductive and respiratory syndrome virus is a classical and / or highly pathogenic and / or NADC30 like strain, and the kit comprises upstream primers and downstream primers. The kit provided by the invention is fast and economical. Classical, highly pathogenic and NADC30_like strains can be distinguished by one PCR reaction. The kit has the advantages of simple operation, low cost and practical value in the identification and detection of the above three strains.
【技术实现步骤摘要】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别检测用试剂盒及其应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种以猪繁殖障碍和呼吸系统疾病为主要症状的病毒性传染病，该传染病能够造成母猪流产、仔猪呼吸障碍等临床症状，具有较高的死亡率。该病毒分为两个基因型，即以LV毒株为代表的欧洲型(基因1型)和以VR2332毒株为代表的北美型(基因2型)。1996年，中国首次分离到以CH-1a为代表的PRRSV经典型毒株；2006年，中国爆发由高致病型PRRSV毒株引起的高致病型PRRSV，该毒株NSP2区存在30个不连续氨基酸缺失；2014年，我国出现了NSP2区存在131个不连续氨基酸缺失的NADC30-like毒株，该毒株致病性介于经典型毒株与高致病型毒株之间。目前我国规模化猪场存在三种病毒的发生与流行，给我国养猪业造成了严重的经济损失。因此，区分三种不同毒株，对于PRRS精准防控具有重要意义。但是PRRS具有一种病毒存在不同毒株的特点，而使用PCR分辨不同病原需要使用不同的体系和程序，使得单重PCR方法操作步骤多且实际用量大，操作繁琐且成本较高。
技术实现思路
针对检测一种病毒不同毒株时单重PCR操作繁琐、成本高的技术问题，本专利技术提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒。以及，本专利技术还提供了一种非诊断目的猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法。以及，本专利技术还提供了一种上述试剂盒在检测含有经典型、高致病型与NADC30-like型猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术实施例采用了如下的技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为包括经典型和/或高致病型和/或NADC30-like型毒株；所述试剂盒包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物的序列为5′-CTCCTTTGATTGGAATGTTGTG-3′；所述下游引物的序列为5′-GATGGCTTGAGCTGAGTATTTTG-3′。本研究根据经典型毒株、高致病型毒株与NADC30-like型毒株NSP2基因组差异，设计了鉴别检测用引物，建立了区分PRRSV三种毒株的PCR鉴别检测用方法并组装了试剂盒。该试剂盒包含的引物是根据GenBank公布的与猪繁殖与呼吸综合征相关的经典型、高致病型、NADC30-like型毒株序列设计所得，可以同时扩增出与待测毒株相关的多条目的DNA片段，既有单重PCR的特异性和敏感性，又较之快捷、经济、易于操作，经过一次PCR反应即可同时鉴别PRRSV三种毒株，在上述三种毒株单独或混合感染的检测方面具有操作简便、成本低的优势和实用价值。优选地，所述经典型毒株扩增片段大小为1072bp，所述高致病型毒株扩增片段大小为985bp，所述NADC30-like型毒株扩增片段大小为682bp。优选地，所述试剂盒还包括5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和2×PCRMix。优选地，所述2×PCRMix由DNA聚合酶、2×PCRbuffer和dNTPMixture组成。所述反转录酶为M-MLV反转录酶。优选地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂。优选地，所述RNA提取试剂包括CarrierRNA、氯仿、异丙醇、75％乙醇。以及，本专利技术还提供了一种非诊断目的猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别检测用方法，用上述试剂盒对离体组织进行经典型、高致病型与NADC30-like型猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测。以及，本专利技术还提供了一种上述试剂盒在检测含有经典型和/或高致病型和/或NADC30-like型猪繁殖与呼吸综合征病毒的产品中的应用。通过对这三种毒株的检测，能够为这三种毒株所引发的猪繁殖与呼吸综合征的鉴别检测提供技术支撑，从而协助其防治和流行病学调查。附图说明图1为本专利技术实施例中经典型毒株PCR特异性检测结果；图2为本专利技术实施例中高致病型毒株PCR特异性检测结果；图3为本专利技术实施例中NADC30-like型毒株PCR特异性检测结果。附图说明：10DL2000Marker11经典型PRRSV12阴性对照20DL2000Marker21高致病型PRRSV22阴性对照30DL2000Marker31NADC30-like型PRRSV32阴性对照具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1本专利技术实施例提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，具体包括：(1)RNA提取试剂：CarrierRNA、氯仿、异丙醇、75％乙醇；(2)反转录试剂：5×反转录缓冲液、浓度为2.5mM的dNTPMixture、浓度为2.5U/μL的M-MLV反转录酶、浓度为30U/μL的RNA酶抑制剂；(3)PCR反应试剂：2×PCRMix(由DNA聚合酶、2×PCRbuffer和dNTPMixture组成)、上游引物、下游引物，其中上游引物的序列为5′-CTCCTTTGATTGGAATGTTGTG-3′，下游引物的序列为5′-GATGGCTTGAGCTGAGTATTTTG-3′，该上游引物和下游引物均为色谱纯的冻干粉；(4)无核酸酶水。实施例2本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用方法，取病死猪的肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏为待测组织，检测步骤具体如下：(1)RNA提取待测组织预处理：将待测组织剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000～5000rpm离心5～10分钟后取上清，得到待测样品。将待测样品进行RNA的提取：将250μL待测样品加入750μLTRIzolLSReagent中，剧烈振荡2min，室温放置5min。加入250μL氯仿，剧烈振荡1min，室温放置5min后，4℃12000rpm离心15min，将上层水相转入新的离心管。加入与水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置15min，4℃12000rpm离心15min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75％乙醇700～800μL，4℃12000rpm离心5min，弃上清。将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行RT-PCR或贮存于-80℃备用。(2)反转录反应分别向上述11μLRNA模板中加入2μL浓度为10μM的下游引物、4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture至20μL，42℃水浴1～2h，即得到cDNA溶液，-20℃保存备用。(3)PCR反应取上述cDNA溶液，进行PCR鉴定。分别在反应管中加入10×EasyTaqBuffer2μL，cDNA2μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，EasyTaqDNApolymerase(5U本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为包括经典型和/或高致病型和/或NADC30‑like型毒株；所述试剂盒包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物的序列为5′‑CTCCTTTGATTGGAATGTTGTG‑3′；所述下游引物的序列为5′‑GATGGCTTGAGCTGAGTATTTTG‑3′。
【技术特征摘要】
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒为包括经典型和/或高致病型和/或NADC30-like型毒株；所述试剂盒包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物的序列为5′-CTCCTTTGATTGGAATGTTGTG-3′；所述下游引物的序列为5′-GATGGCTTGAGCTGAGTATTTTG-3′。2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，其特征在于，所述经典型毒株扩增片段大小为1072bp，所述高致病型毒株扩增片段大小为985bp，所述NADC30-like型毒株扩增片段大小为682bp。3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括5×反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和2×PCRMix。4.根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒鉴别检测用试...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁万哲，王建昌，刘娜，孟令宅，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北,13
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