一种苦味受体多个基因敲除的小鼠模型构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种苦味受体多个基因敲除的小鼠模型构建方法及应用

【技术实现步骤摘要】
一种苦味受体多个基因敲除的小鼠模型构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种苦味受体多个基因敲除的小鼠模型构建方法及应用，特别涉及一种使用
Crispr/cas9
技术对苦味受体
mTas2r105
基因簇进行基因突变
/
基因敲除，进而利用金葡菌滴鼻感染建立苦味受体基因敲除小鼠肺部感染模型的方法，属于生物医学与动物模型

。

技术介绍

[0002]现代生物学将人类味觉分为五种基础味觉，即咸味
、
酸味
、
苦味
、
甜味和鲜味，这五种味觉信息是通过味觉受体及其下游信号传导通路的协调运作而传递的
。
前两种味觉信息是通过味蕾细胞上的离子通道或门控离子通道进行传导的；后三种味觉信息则依赖于两大类
G
‑
蛋白偶联受体
(GPCRs)
家族，即
T1Rs
和
T2Rs。T1Rs
编码甜味和鲜味的受体蛋白，
T2Rs
则编码苦味的受体蛋白
。
人
T2Rs
家族则包括～
25
种苦味受体，小鼠则包括～
35
种苦味受体
(Stephen D.Roper&Nirupa Chaudhar
，
Nat Rev Neurosci.2017 18(8):485
–
497.doi:10.1038/nrn.2017.68
；
Chandrashekar C et al.
，
Nature.2006Nov16
；
444(7117):288
‑
94.doi:10.1038/nature05401
；
Chaudhari N&Roper SD.J Cell Biol.2010 9
；
190(3):285
‑
96.doi:10.1083/jcb.201003144)。
[0003]最初的研究仅仅将这些味觉受体局限在舌上味蕾中，近年的研究显示这些味觉受体
(
包括
T1Rs
和
T2Rs)
在体内存在广泛的分布，在体内很多种上皮组织均存在特异性表达
(Finger TE
，
Kinnamon SC.F1000 Biol Rep.2011
；
3:20.doi:10.3410/B3
‑
20)。
尽管苦味受体众多，但是转基因小鼠研究显示苦味受体的表达存在组织特异性
。
例如
mTas2r105
基因簇在气管
、
肠道
、
睾丸
、
舌下腺
、
肾脏
(
近端肾小管和肾小球
)
存在表达
(Feng L.
，
Mol Hum Reprod.2013 19(6):349
‑
60.doi:10.1093/molehr/gat009)
，
mTas2r131
则在上呼吸道
、
下呼吸道
(
气管
、
肺部
)、
肠道
、
睾丸
、
卵巢
、
胸腺
、
脑区存在表达，而在肾脏
、
心脏不表达
(Voigt A
，
Chem Senses.2012Nov
；
37(9):897
‑
911.doi:10.1093/chemse/bjs082)
，
mTas2r143/mTas2r135/mTas2r126
在心脏
、
胃肠道
、
呼吸道
、
胸腺
、
雌性生殖道上皮表达
(Lu P et al.
，
J Cell Physiol.2021 236(9):6407
‑
6423.doi:10.1002/jcp.30315)。
这就说明苦味受体基因在不同的组织器官可能存在不同的表达谱及不同的生物学功能
。
[0004]苦味受体
T2Rs
在呼吸系统的分布及生物学功能研究较详细
。T2Rs
在人和小鼠呼吸道平滑肌细胞和呼吸道上皮细胞中均存在表达
。
苦味化合物可通过激活呼吸道平滑肌细胞
T2Rs
来影响平滑肌的扩张反应，也可通过激活呼吸道上皮细胞
T2Rs
而增加胞内
Ca
2+
浓度，最终导致上皮细胞动力纤毛摆动频率加强而排出有毒物质
(Lee RJ
，
J Clin Invest.2014Mar
；
124(3):1393
‑
405.doi:10.1172/JCI72094)。
最近的系列研究揭示了苦味受体和细菌感染
、
固有免疫之间的关系
。
在人上呼吸道
(
包括鼻窦粘膜上皮细胞
)
表达苦味受体
hT2R38
，革兰氏阴性菌感染上呼吸道后细菌分泌酰基高丝氨酸环内酯
(AHL)
，
AHL
可以有效激活表达在鼻窦纤毛细胞的苦味受体
hT2R38
，继而触发胞内
Ca
2+
信号，通过激活一氧化氮合成酶而促进一氧化氮
(NO)
的产生
。
一氧化氮一方面可以激活蛋白硫酸化酶
G(PKG)
，磷
酸化纤毛蛋白而增加纤毛摆动频率；另一方面它渗透到鼻腔液中直接杀死细菌
。
甜味受体
hT1R2/hT1R3
可以拮抗苦味受体
hT2Rs
的上述作用
(Lee RJ
，
Cohen NA.Cell Mol Life Sci.2015Jan
；
72(2):217
‑
36.doi:10.1007/s00018
‑
014
‑
1736
‑
7)。
进一步研究发现
AHL
诱导粘膜上皮细胞产生
NO
的能力和苦味受体
hT2R38
的基因型相关
。
来自苦味受体
hT2R38
基因型
AVI/AVI(
对苯硫脲
PTC
不敏感
)
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种苦味受体多个基因敲除的小鼠模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：分别合成针对苦味基因
Tas2r104、Tas2r105、Tas2r106、Tas2r114
或基因
Gnat3
的
sgRNA
及
Cas9 mRNA
；步骤2：通过显微共注射的方法将步骤1中合成的四种
Tas2r
苦味基因
sgRNA
的组合
、Gnat3
基因
sgRNA
分别和
Cas9 mRNA
混合后注射入小鼠原核期受精卵中；步骤3：将注射后的受精卵移植入假孕母
ICR
雌鼠的输卵管壶腹膨大部位，待小鼠出生后，通过
T7E1
酶切法及
PCR
扩增进行初步鉴定；步骤4：对初步鉴定正确的小鼠产物进行
T
载体连接
、
转化
、
挑取单克隆进行测序确认；步骤5：测序正确的基因敲除小鼠为
F0
代子鼠，将
F0
子代小鼠和野生型
C57BL/6
小鼠连续级进杂交5代以上，通过基因型鉴定获得杂合子小鼠；步骤6：将杂合子小鼠互交，获得四种
Tas2r
苦味基因中的一个或多个
Tas2r
基因敲除小鼠和
Gnat3
基因敲除小鼠
。2.
根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤6中获得了五个品系的基因敲除小鼠
Tas2r104
‑
/
‑
/Tas2r105
‑
/
‑
、Tas2r114
‑
/
‑
/Tas2r105
‑
/
‑
、Tas2r104
‑
/
‑
/Tas2r105
‑
/
‑
/Tas2r114
‑
/
‑
、Tas2r106
‑
/
‑
和
Gnat3
‑
/
‑
。3.
根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，还包括步骤7：步骤6获得的
Tas2r
基因敲除小鼠和
Gnat3
基因敲除小鼠进行杂交获得相应的双基因敲除小鼠模型
。4.
根据权利要求1～3中任意一项所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤6或7获得的小鼠模型进一步通过细菌感染制备细菌感染小鼠模型
。5.
根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述步骤1中合成
sgRNA
及
Cas9 mRNA

【专利技术属性】
技术研发人员：李峰，刘玲玲，牛博文，周晓辉，朱孟敏，秦波音，陈丽香，杨华，彭秀华，徐春华，
申请(专利权)人：上海市公共卫生临床中心，
类型：发明
国别省市：