一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT‑PCR引物和探针及方法与应用，该引物和探针的序列如SEQ ID NO:1～3所示。本发明专利技术可快速、特异、灵敏地检测猪非典型瘟病毒，最低检测浓度为5copies/μL。本发明专利技术使用的操作方法简单、反应结果易于判断，灵敏性和检出率高，并且能够避免假阳性现象，适用于疾病监测、现场应急及临床样品的检测，适合大范围推广应用。

* a fluorescent quantitative RT-PCR primer and probe for detecting porcine atypical distemper virus and its application

The invention discloses a fluorescent quantitative RT * PCR primer and probe for detecting porcine atypical distemper virus, and a method and application thereof. The sequence of the primer and probe is shown as SEQ ID NO:1 ~ 3. The invention can detect swine atypical virus quickly, specifically and sensitively, with a minimum detection concentration of 5copies/ * L. The method is simple, the reaction result is easy to judge, the sensitivity and the detection rate are high, and the false positive phenomenon can be avoided. The method is suitable for disease monitoring, on-site emergency and the detection of clinical samples, and is suitable for wide-range popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用
本专利技术属于病毒检测
，具体地说，涉及一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用。
技术介绍
猪非典型瘟病毒(Atypicalporcinepestivirus，APPV)是近几年来新发现的一种新型瘟病毒，与猪瘟(Classicalswinefevervirus，CSFV)、牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、边境瘟病毒(Borderdiseasevirus，BDV)等同属瘟病毒属(Pestivirus)黄病毒科(Flaviviridae)。其发病特征是在出生后数小时内可观察到骨骼肌的双侧痉挛收缩，并造成无法吮乳的现象，严重时可损伤仔猪的脑和脊髓，并导致仔猪死亡。在临床上症状轻重不一，有的仔猪是全身一致的、有节奏的震颤，无法站立，在躺卧后震颤减轻或停止。有的仔猪全身震颤程度不一，仅头部、颈部震颤强烈，不能准确吃奶但仍可正常运动。2015年，美国Hause研究小组检测并证实了该病毒的存在，同时指出APPV可能导致仔猪先天性震颤。随后，该病毒在德国、荷兰、西班牙、奥地利等地相继被报道。在2017年，该病毒被我国华南农业大学宁永章课题组首次发现。目前对于猪非典型瘟病毒尚无预防用生物制品，能准确、快捷、有效的检测猪非典型瘟病毒(APPV)对于提高对该病毒的防控是至关重要的。目前，根据研究数据表明，该病毒的基因序列变异快，不同毒株之间基因序列差异大，国外建立的检测方法在国内并不适用，而国内已有的普通PCR和荧光检测试剂盒又易出现假阳性问题，因此其检测结果的准确性是有待考究的。由此可见，我国对于该病毒的检测技术还需要进一步的完善。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针及方法与应用，本专利技术在多株APPV基因序列比对基础上，基于5’端基因设计了特异性引物和探针，对猪非典型瘟病毒进行快速、准确地鉴别，具有简单、快速、灵敏度高和特异强的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，包括上游引物APPVF、下游引物APPVR以及探针APPVProbe，其中，上游引物APPVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物APPVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，探针APPVProbe的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还公开了一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR的方法，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物和探针对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT值＝0时，则记为阴性。可选地，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScriptBuffer4μL、2号PrimeScriptRTEnzymeMix1μL、4号Random6mers2μL和5号RNaseFreedH2O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。可选地，所述反转录反应所需试剂为宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT试剂。可选地，荧光定量PCR反应检测体系为：PremixExTaq(ProbeqPCR)10μL，上游引物APPVF、下游引物APPVR各0.5μL，探针APPVProbe0.8μL，cDNA模板100ng，用ddH2O补齐到20μL。可选地，所述的荧光定量RT-PCR反应条件为:95℃预变性2min；PCR:95℃反应15sec，54℃反应20sec进行40个循环。本专利技术还公开了一种上述的检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针在猪非典型瘟病毒的快速诊断中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)引物针对的基因靶标不同：本专利技术设计的引物是基于APPV5’端，在瘟病毒中5’端序列相对保守，适合用做引物和探针的设计靶点。而公开的检测方法的引物是基于APPVNS3和APPVE2基因设计的引物。2)引物设计的可检测范围不同：本专利技术设计的引物是根据国内外公布的所有APPV病毒序列，能够同时对国内外现有的毒株进行检测，而设计范围在高度保守的5’端序列。3)本专利技术不仅操作步骤少，只需要常规的提取核酸，进行反转录后就能进行探针荧光定量PCR检测；能节约大量时间，整个扩增只需要1h即可完成，检测的灵敏度到5copies/μL。4)本专利技术的阳性结果鉴定便捷，只需要判断其CT值是否大于“0”即可；比检测APPV的核酸电泳或荧光定量PCR的方法更加快捷、准确，且能很好的避免SYBRGreen荧光定量PCR实验中假阳性的现象，为猪非典型瘟病毒的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术阳性模板经52℃-58℃7个退火温度PCR扩增后曲线图；其中，N代表阴性对照，1-7代表同一个实验样本；图2是本专利技术引物特异性实验结果图；其中，1：APPV病毒样品；2：猪瘟病毒样品；3：猪蓝耳病毒样品；4：伪狂犬病毒样品；5：牛病毒性腹泻样品；6：大肠杆菌样品；7：沙门氏菌样品。图3是本专利技术引物灵敏度实验的检测结果图，其中A:5×108拷贝/μL；B:5×107拷贝/μL；C:5×106拷贝/μL；D:5×105拷贝/μL；E:5×104拷贝/μL；F:5×103拷贝/μL；G:5×102拷贝/μL；H:5×10拷贝/μL；I:5拷贝/μL。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1引物设计根据NCBI登陆的APPV基因的国内外已经发表的毒株序列(KU041637，KU041638，KU041639，KU194229，KX929062，KX929063，KX929069，LT594521)，应用BeaconDesigner7.7软件设计针对APPV的5’端基因的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物APPVF：YGAGTAGTACACCCAAAG(其中Y代表T或C)，SEQIDNO:1；下游引物APPVR：CACCACCGATTTCTCTTT，SEQIDNO:2；探针序列APPVProbe：CYGAGCCTCAGTAGACCCT(其中Y代表T或C)SEQIDNO:3。实施例2检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR方法的建立：该方法包括以下步骤：(1)待检测样品RNA提取：待检血液样品经过8000g离心5min，取上层血清各用；组织器官样品需要以1:5的质量体积比与灭菌双蒸水混合，研磨后8000g离心5min，取上清液，备用。(2)提取的RNA加入到购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA模板：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT‑PCR引物和探针，其特征在于，包括上游引物APPV F、下游引物APPV R以及探针APPV Probe，其中，上游引物APPV F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物APPV R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，探针APPV Probe的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR引物和探针，其特征在于，包括上游引物APPVF、下游引物APPVR以及探针APPVProbe，其中，上游引物APPVF的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，下游引物APPVR的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，探针APPVProbe的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。2.一种检测猪非典型瘟病毒的荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待检测样品的RNA，以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求1中所述的引物和探针对cDNA进行荧光定量RT-PCR扩增；通过实时荧光定量PCR仪进行结果的读取，判断S型扩增曲线和CT值，在扩增曲线正常的情况下，若CT值＞0时，则可记为阳性，若CT值＝0时，则记为阴性。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL、1号5×PrimeScriptBuffer4μL、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，周可磊，岳华，汤承，王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51