一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。所述荧光定量PCR试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物和SEQ ID NO.3所示的探针，以及标准品和荧光定量PCR反应试剂。本发明专利技术的荧光定量PCR试剂盒可以对该新型鸭呼肠孤病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鸭呼肠孤病毒特异性结合，与其他鸭源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为4×101‑4×109拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，可以高效检测新型鸭呼肠孤病毒病鸭组织以及无临床症状的病毒携带鸭，提高了检测效率。

A fluorescence quantitative PCR kit for detection of new duck reovirus and its application

The invention discloses a fluorescent quantitative PCR kit for detecting new duck reovirus and its application. The fluorescence quantitative PCR kit contains the primers shown in SEQ ID NO.1_SEQ ID NO.2 and the probes shown in SEQ ID NO.3, as well as the standard and fluorescence quantitative PCR reaction reagents. The fluorescent quantitative PCR kit of the invention can detect the new duck reovirus, and the kit has strong specificity, and only binds specifically with the new duck reovirus, and has no cross-reaction with other Duck-Derived viruses; moreover, the detection sensitivity is high, and it is excellent in the range of 4 *101_4 109 copies of the standard sample. Linear relationship, detection range can reach 9 orders of magnitude, can effectively detect the new type of duck reovirus disease duck tissues and asymptomatic virus-carrying ducks, improve the detection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用
本专利技术涉及禽病毒检测
，具体涉及一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。
技术介绍
禽呼肠孤病毒属于呼肠孤病科(Reovirdae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)，可以引起禽类发生多种疾病，其临床表现因病毒毒株、毒力或感染宿主的不同而有差异。2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病，该病主要引起各个年龄阶段鸭跗关节肿胀，跗关节常含有少量黄色或血样渗出物，严重病例，关节腔中有干酪样渗出物，患鸭出现不同程度的跛行。该病主要导致种鸭产蛋和肉鸭体重的下降，料肉比升高，肉鸭出栏合格率显著降低，对肉鸭以及种鸭养殖业造成严重经济损失。经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鸭呼肠孤病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，现有市售的鸭呼肠孤病毒疫苗无法对该病进行有效的防控；常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。在当前这种情况下，控制该病的有效措施是对该新型鸭呼肠孤病毒感染进行监测，以便及早发现感染鸭群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸭呼肠孤病毒感染所带来的损失。目前，对于禽呼肠孤病毒的检测方法主要包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类，其中，细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养和电镜观察。该方法操作较为繁琐，检测周期长，检测条件要求较高。免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光方法，该类方法灵敏较高，但对抗体要求也高。分子生物学诊断技术主要包括传统聚合酶链式反应(PCR)方法以及荧光PCR方法，而传统PCR方法只能对病毒感染定性，不能定量，灵敏度也较低；荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛的应用。目前已有采用荧光定量PCR方法检测牛群中呼肠孤病毒的报道，但由于该新型鸭呼肠孤病毒系首次报道，针对哺乳动物和其他禽类的呼肠孤病毒诊断策略不能用于该新型鸭呼肠孤病毒的检测，迄今仍未有检测该新型鸭呼肠孤病毒的有效方法。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒及应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供一组引物和探针，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。具体如下：正向引物：M1-F：ATTATCCATTTTGAGATCCACG；(SEQIDNO.1)反向引物：M1-R：TTGGTTGCTTTCCTAGCGCTT；(SEQIDNO.2)荧光探针：5’-FAM-TGCGAGTCGGTTCTAGTCGCA-TMARA-3’；(SEQIDNO.3)本专利技术的第二方面，提供上述引物和探针在制备检测新型鸭呼肠孤病毒的试剂或试剂盒中的应用。所述新型鸭呼肠孤病毒已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：V201818，地址：中国武汉，武汉大学。本专利技术的第三方面，提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒，所述荧光定量PCR试剂盒含有上述的引物和探针。所述鸭呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201818。进一步的，所述荧光定量PCR试剂盒中还包括：标准品和荧光定量PCR反应试剂。优选的，所述标准品由如下方法制备而成：采用SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示的引物扩增保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到pMD18-T载体上，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，即制备得到标准品。所述荧光定量PCR反应试剂包括：OneStepRT-PCRBuffer、TaKaRaExTaqHS、PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ和ROX参比染料。本专利技术的第四方面，提供一种检测新型鸭呼肠孤病毒的检测试剂，所述检测试剂含有上述的引物和探针。本专利技术的第五方面，提供上述荧光定量PCR试剂盒或上述检测试剂在如下(1)-(3)中任一种中的应用：(1)对鸭感染新型呼肠孤病毒进行流行病学调查；(2)对血液或血清制品中的新型鸭呼肠孤病毒污染进行监控；(3)精确检测新型鸭呼肠孤病毒拷贝数，明确新型鸭呼肠孤病毒的感染进程。本专利技术的第六方面，提供一种利用上述荧光定量PCR试剂盒检测鸭呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤：(1)将标准品进行梯度稀释，之后进行TaqMan荧光PCR反应，根据标准品的浓度和Ct值，绘制荧光定量标准曲线；(2)提取待测样品总RNA，进行TaqMan荧光PCR反应，收集待测样品荧光信号，对荧光信号进行数据处理，得到Ct值及扩增曲线，对待测样品进行定性和定量检测。优选的，步骤(1)和步骤(2)中，TaqMan荧光PCR反应的程序为：42℃5min；95℃10s；之后95℃5s，60℃34s，40个循环。本专利技术的有益效果：(1)针对新发现的能够导致雏鸭跗关节肿大的新型鸭呼肠孤病毒，本专利技术设计了可以对该新型鸭呼肠孤病毒进行检测的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的特异性强，只与新型鸭呼肠孤病毒特异性结合，与其他鸭源病毒，如鸭细小病毒，鸭坦布苏病毒，鸭流感病毒等都没有交叉反应。(2)检测的灵敏度高，在标准品为4×101-4×109拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，可以高效检测新型鸭呼肠孤病毒病鸭组织以及无临床症状的病毒携带鸭，提高了检测效率。(3)采用本专利技术的试剂盒能够对新型鸭呼肠孤病毒感染进行监测，以便及早发现感染鸭群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸭呼肠孤病毒感染所带来的损失；还可以对鸭感染呼肠孤病毒进行流行病学调查，以及对血液或血清制品中的鸭呼肠孤病毒污染进行监控。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。正如
技术介绍
所介绍的，2016年起，我国山东、河北、河南及江苏等地鸭大范围爆发以跗关节肿大为主要症状的传染性疾病。该病的症状不同于以往的鸭呼肠孤病毒感染，首次在鸭群中出现了跗关节肿大的症状，由此推知，该传染性疾病可能是由新型呼肠孤病毒所引起的。目前尚无能够有效控制该新型鸭呼肠孤病毒感染的药物和方法。基于此，本专利技术提出了一种能够检测该新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒，以便能及早发现感染鸭群对其采取隔离或扑杀措施，以减少新型鸭呼肠孤病毒感染所带来的损失。我们知道，禽呼肠孤病毒的宿主范围较广，各种禽类中普遍存在这种病毒，自1954年以来已经在鸡、鹅、鸽子、鸵鸟、鸭、火鸡及其它野鸡等多种发病或是健康的禽类中分离到呼肠孤病毒，而从不同宿主中分离到的呼肠孤病毒其存在较大的变异性，其致病性、基因序列和主要蛋白的编码都存在差异。本申请专利技术人从发病鸭肿胀的肌腱组织中分离出一株鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16，对上述新分离的鸭呼肠孤病毒N-DAV-SD16进行了全基因组测序，并分别将10个基因片段与现有报道的禽呼肠孤病毒进行了序列比对和同源性分析，结果发现，新分离毒株N-DAV-SD16的10个基因片段中L1、L2、L3、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一组引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的引物和探针在制备检测新型鸭呼肠孤病毒的试剂或试剂盒中的应用；所述新型鸭呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201818。3.一种检测新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒含有权利要求1所述的引物和探针。4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR试剂盒中还包括：标准品和荧光定量PCR反应试剂。5.根据权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述标准品由如下方法制备而成：采用SEQIDNO.1-SEQIDNO.2所示的引物扩增保藏编号为CCTCCNO：V201818的鸭呼肠孤病毒的基因组，得到扩增产物，将扩增产物连接到pMD18-T载体上，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，即制备得到标准品。6.根据权利要求4所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应试剂包括：OneStepRT-PCRBuffer、TaKaRaExTaqHS、PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ和ROX参比染料。7.一种检测新...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐熠，刁有祥，王鸿志，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37