一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法，包括PCR反应缓冲液A、FMDV引物探针混合液B、酶系C、阴性对照和阳性对照，检测方法为：样本采集与处理；样本RNA的提取；对样本RNA进行提取；PCR反应体系的配制；加样；扩增；结果判读。本发明专利技术具有灵敏度高、效率高等优点。

A Taqman real-time fluorescence PCR kit for detection of foot-and-mouth disease virus and its detection method

The invention discloses a Taqman real-time fluorescent PCR kit for detection of foot-and-mouth disease virus and a detection method thereof, including PCR reaction buffer A, FMDV primer probe mixture B, enzyme system C, negative control and positive control. The detection methods are: sample collection and processing; sample RNA extraction; sample RNA extraction; PCR reverse control. Preparation of the system; sampling; amplification; result interpretation. The invention has the advantages of high sensitivity and high efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及分子诊断
，具体来说是一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。
技术介绍
口蹄疫(Footandmouthdisease,FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起的一种动物传染性疫病，主要侵染偶蹄类动物，以猪、牛和羊易感，偶见人与其他动物。患病动物的口、鼻、蹄等部位以及雌性动物的乳头等无毛处多发水疱。另外感染动物易出现精神抑郁、跛行、流涎等症状。成年个体死亡率较低，而幼年个体的死亡率则高达100％。FMD是一种人畜共患病，对养殖业及人类健康均可造成严重的威胁，是国家要求强制免疫的重大动物疫病之一。目前，FMD对畜牧养殖业及人类健康构成巨大威胁，是世界动物卫生组织(OfficeInternationaldesepizooties,OIE)法定报告的动物传染病之一。FMDV变异迅速，常呈现多个血清型并存的现象。根据FMD在全球的分布现状，大多数国家主要流行O型，我国则以O型为主，A型和亚洲Ⅰ型(AsiaⅠ型)散发，O型以SEA型(东南亚型，俗称缅甸98谱系)为主，同时出现新毒株变异，每种血清包含不同的拓扑型，疫苗株包括Mya98/by/2011,O/×J/10-11。我国流行的另外两种O型FMD包括CATHAY型(中国型)和ME-SA型(中东南-亚型)。FMDV的传播有发病快、传染广、发病率高等特点。最主要的直接传染源是病猪和带毒猪，病猪发病初期传染性最高，并且50％左右患病动物在病愈后的数周乃至数月仍可携带病毒。病猪的水疱皮、水疱液、肉、毛、内脏、血液、泪液及其他排泄物也可能成为传染源。另外，被污染的猪舍、饲料、水、饲养用具也存在传播风险。FMDV主要通过空气或接触传播。空气传播的途径是感染动物呼出的FMDV在空气中形成气溶胶粒子，易感动物吸入被污染的空气，即可引发病毒感染；接触传播主要通过发病动物与易感动物的直接接触传播，如圈舍、畜牧场、集贸市场与运输车辆内的动物直接接触；间接接触主要通过媒介物机械性带毒而传播。FMDV的生命力顽强，可依附在空气中的微小尘埃，随风移动，甚至出现跨越数10km传播。FMDV属于小RNA病毒科，为单股正链病毒，其基因组由约8450个碱基组成，血清型复杂多变，已发现7个血清型，即A型、O型、C型、南非(SAT)I型、南非II型、南非III型和亚洲I型，每个型又有多种亚型，各血清型无交叉免疫保护作用。FMDV传染性极强，对病畜和疑似感染动物必须紧急扑杀，对疫病周围的广大地区需要隔离封锁，禁止动物转运和畜产品上市，进出口贸易也要停止，间接经济损失更大，成为影响国民经济发展的“政治经济病”。因此快速准确的病原检测方法对FMD的防控和净化十分重要。目前，FMDV检测方法主要包括病毒分离、间接夹心酶联免疫吸收试验、反向间接血凝试验、反向聚合酶链式反应和多重反转录聚合酶链式反应等。传统的动物接种及血清学试验在检测FMDV时存在耗时、繁琐和灵敏度不高等缺点间接ELISA试验虽然操作简单、快速，但需要大量的标准抗原。目前广泛应用的常规RT-PCR检测方法虽然简单、方便、快速和敏感度较高，单仍然存在假阳性和PCR污染等弊端。TaqMan实时荧光PCR技术其特异性强、灵敏度高、速度快和防污染等优点在基因表达水平分析、病原检测和定量检测等方面得到广泛应用，并已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的效率低下、灵敏度不高的缺陷，而提供一种检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其检测方法。本专利技术解决上述技术技术问题，本专利技术公开了一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，包括PCR反应缓冲液A、FMDV引物探针混合液B、酶系C、阴性对照和阳性对照。作为优选，各组分含量如下：PCR反应缓冲液A为384μl，FMDV引物探针混合液B为48μl，酶系C96μl，阴性对照400μl，阳性对照400μl。作为优选，所述的PCR反应缓冲液A的组分为5×PCRbuffer(Mg2+Plus)和dNTPs组成，所述的酶系C的组分为热启动DNA聚合酶、SuperM-MLV、RRI的混合物，所述的阴性对照采用DEPC-H2O，所述的阳性对照采用口蹄疫目的基因片段的质粒菌。作为优选，所述的FMDV引物探针混合液B是由一对引物和一条特异性荧光探针组成，所述的引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述的荧光探针的序列如SEQIDNO:3所示，所述的引物序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为：SEQIDNO:1：上游引物ACAAACCTGTGATGGCYTSEQIDNO:2：下游引物GGAGATCAACTTCTCCTGTA所述的探针序列为：SEQIDNO:3：CTCTCCTTTGCACGCCGTG。作为优选，所述的引物序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的扩增序列和序列SEQIDNO:3的探针引物浓度均为10uM/ul，扩增引物与探针引物配比为2:2:1。作为优选，本专利技术的另一目在于还提供了利用上述用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒检测口蹄疫的荧光PCR反应体系：扩增体系：本专利技术还提供了采用上述用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒检测口蹄疫的检测方法，具体步骤如下：(1)、样本采集与处理活体样本：用采样枪采取扁桃体样本，用灭菌牙签挑至1.5ml离心管并作标记，按1:5倍体积加入DEPC水，于碾钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清转入离心管中备用；内脏样本：取50～100mg待测样本按1:5倍体积加入DEPC水，于碾钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g离心15min，取上清转入离心管中备用；鼻拭子：用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件下送实验室检测；血液样品：用无菌注射器采集血液，注入含1/104％EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用；标本保存和运输：样本可立即用于检测；如不立即检测，样本在4℃保存不超过24小时，-20℃保存不超过3个月，-70℃可长期保存，反复冻融不超过5次；样本应由专业人员专人运送；短途运送加冰袋保冷即可；长途运送需加干冰保冷；(2)、样本RNA的提取对样本RNA进行提取；(3)、PCR反应体系的配制在试剂配制室对PCR反应体系进行配制，其中PCR反应缓冲液A16μl，酶系B2μl、引物探针混合液C2μl，将PCR反应缓冲液A按20μl/管分装至PCR反应管中，将装有PCR反应液的反应管移至样本处理区；(4)、加样用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样本、阴性对照、阳性对照上清各5μl分别加到装有反应体系的PCR反应管中，盖上管盖，离心数秒后移至扩增检测区；(5)、扩增将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测；循环参数设定：(AB：ABI7500FAST，Anlong：ProEco48，SLAN-96)：(6)结果判读6.1阴性结果判定：在FAM通道扩增曲线均不成S型且Ct值为UNDET；6.2阳性结果判定：样本在FAM通道扩增曲线呈S型且C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括PCR反应缓冲液A、FMDV引物探针混合液B、酶系C、阴性对照和阳性对照。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：包括PCR反应缓冲液A、FMDV引物探针混合液B、酶系C、阴性对照和阳性对照。2.根据权利要求1所述的一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：各组分含量如下：PCR反应缓冲液A为384μl，FMDV引物探针混合液B为48μl，酶系C96μl，阴性对照400μl，阳性对照400μl。3.根据权利要求1或2所述的一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应缓冲液A的组分为5×PCRbuffer(Mg2+Plus)和dNTPs组成，所述的酶系C的组分为热启动DNA聚合酶、SuperM-MLV、RRI的混合物，所述的阴性对照采用DEPC-H2O，所述的阳性对照采用口蹄疫目的基因片段的质粒菌。4.根据权利要求1或2所述的一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的FMDV引物探针混合液B是由一对引物和一条特异性荧光探针组成，所述的引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，所述的荧光探针的序列如SEQIDNO:3所示，所述的引物序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为：SEQIDNO:1：上游引物ACAAACCTGTGATGGCYTSEQIDNO:2：下游引物GGAGATCAACTTCTCCTGTA所述的探针序列为：SEQIDNO:3：CTCTCCTTTGCACGCCGTG。5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述的引物序列SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的扩增序列和序列SEQIDNO:3的探针引物浓度均为10uM/ul，扩增引物与探针引物配比为2:2:1。6.一种利用权利要求1或2所述的用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒检测口蹄疫的荧光PCR反应体系，其特征在于扩增体系如下：扩增体系：7.一种采用权利要求1或2所述的用于检测口蹄疫病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒检测口蹄疫的检测方法，具体步骤如下：(1)、样本采集与处理活体样本：用采样枪采取扁桃体样本，用灭菌牙签挑至1.5ml离心管并作标记，按1:5倍体积加入DEPC水，于碾钵或组...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐邦伟，王勇，葛好林，
申请(专利权)人：上海申亚动物保健品阜阳有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34