本发明专利技术公开了一种检测埃博拉病毒(EBOV)的荧光定量PCR检测方法及其引物和试剂盒。本发明专利技术是一种通用型检测方法，只要待检样品中有Z、S、B、C、R五种亚型EBOV中的任何一种或者多种同时存在，就能检测出来阳性。本发明专利技术利用PCR技术的核酸高效扩增、SYBR?Green?I荧光染料和计算机辅助荧光检测技术敏感性的优点，克服了常规PCR检测的不足，极大的提高了检测的敏感性、特异性和操作的便利性。同时，本发明专利技术中采用的阳性对照是NP基因体外转录的一段RNA分子，相对于以灭活病毒液作为阳性对照的检测，增加了安全性。体外转录的RNA分子还可以大量制备，阳性对照来源稳定、可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，特别涉及一种埃博拉病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
埃博拉出血热(Ebolahemorrhagic fever,EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EB0V)引起的，主要以人和非人类灵长类动物为易感动物的急性出血性传染病。该病1976年首次发生于埃博拉河流域的刚果民主共和国(前扎伊尔)，因感染者全身呈出血症状，故命名为埃博拉出血热。据推测最初人类感染EBOV主要是因为人类接触感染了病毒的动物宿主或者间接宿主的身体。在这之后人与人之间通过直接接触已经感染了病毒的人的身体进行传播。在经历一段2-21天的潜伏期之后，感染病毒的病人就会出现一些发热的症状。EHF的主要特征是迅速发热，寒冷，头痛和肌肉疼痛，之后会产生咽喉肿痛，恶心，呕吐，腹泻以及腹痛。大约一半的病人会出现出血症状，例如从鼻孔出血，出现血尿或者是胃肠出血和阴道出血。EHF目前为止主要呈现地方性流行，绝大部分集中于非洲。非洲以外地区偶有病例报道，均属于输入性或实验室意外感染，未发现有EHF流行。EBOV已经被证实是通过体液传播的，如口腔和结膜接触传播，这在非人灵长类动物试验已确证。自然界的动物各种行为和其它因素都有可能造成EBOV的爆发。为了防止EBOV进入我国，对我国的经济以及人身安全造成严重的损失，目前我国急需建立一种快速、准确、敏感的检测方法。EHF的病原是EB0V，属于丝状病毒科(Filoviridae)丝状病毒属(Filovirus)成员，是非分节段的单股负链RNA病毒。目前已鉴定的埃博拉病毒有5种亚型，分别是:EBOV-扎伊尔型(Ebola-Zaire，简称 EB0V-Z)，EBOV-苏丹型(Ebola-Sudan 简称 EB0V-S)，EBOV-本迪布焦型(Ebola-Bundibugyo,简称 EB0V-B), EBOV-科特迪瓦型(Ebola-1voryCoast,简称 EB0V-C)，EBOV-莱斯顿型(Ebola-Reston，简称 EB0V-R)。感染 EB0V-Z，EB0V-S和EBOV-B的致死率大约在2 5% -90%。EBOV属于我国必须严密监控其传播入我国的急性烈性外来人兽共患传染病，建立一种敏感、特异的，能够同时检测EB0V5种亚型病毒的检测方法对我国EBOV的防控工作具有重要意义。荧光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特点，SYBR Green I荧光定量PCR利用SYBR Green I能结合到双链DNA的小沟部位放出荧光的方法广泛应用于核酸的特异性检测。在EBOV的检测方法研究领域，IgG-捕获ELISA和IgM-捕获ELISA是仅有的两类常用检测方法，建立一种敏感、特异的，同时针对5种亚型EBOV的荧光定量PCR方法更具有重要的实践意义。经对现有技术的文献检索发现，国内没有EBOV检测技术的专利公布。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对没有EBOV荧光定量PCR检测技术的问题，提供一种EBOV 5种亚型的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。该方法检测的敏感性可达到100个拷贝的病毒RNA分子，对于单个样本检测小于2个小时，操作简易，可以进行高通量的样品检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的。本专利技术的技术方案一为，一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子，所述的遗传标记分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中连续的50-273个核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中连续的50-196个,优选196bp个核苷酸,所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virusstrain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范围内的核苷酸片段都是本专利技术保护的检测埃博拉病毒的遗传标记。优选的，所述的遗传标记分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。更优选的，所述的遗传标记分子是SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQID NO :4、或SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸。 本专利技术的技术方案二为，一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子的弓I物对，所述的引物长度 25-38 个核苷酸，且一个与 SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、或 SEQ ID NO :5 所示序列相同，另一个相应的与 SEQ ID NO USEQ ID NO :2、SEQ IDNO 3, SEQ ID NO :4、或SEQ IDNO :5所示序列互补，并且扩增产物的长度为50_300bp，优选297bp。优选的，所述的 引物对中，一条引物的序列是SEQ ID NO :6、另一条是SEQ ID NO:7;或者一条是SEQ ID NO :8、另一条是SEQ ID NO :9 ;或者一条是SEQ ID N0:10、另一条是SEQ ID NO : 11 ;或者一条是 SEQ ID NO :12、另一条是 SEQ ID NO : 13 ;或者一条是 SEQ IDNO :14、另一条是 SEQ IDNO :15。本专利技术的技术方案三为，一种检测埃博拉病毒的弓I物对，该弓I物对中，引物长度15-30bp，更佳的是20-22，其中一个引物含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点相同，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列相同或有个别不同，但是不影响PCR扩增反应；另一个引物也含有一到两个简并碱基，该简并碱基分别和Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列的差异位点互补，该引物中该简并碱基以外的序列与Z、S、B、C、R五种亚型EBOV的特异性遗传标志序列互补或有个别不互补，但是不影响PCR扩增反应，该引物对的扩增片段为70-300bp。优选的，所述的引物对中，一条是SEQ ID NO :16所示序列的核苷酸，另一条是SEQID NO :17所示序列的核苷酸。该引物对的扩增片段为196bp。本专利技术的技术方案四为，一种检测埃博拉病毒的PCR试剂盒，该试剂盒包括如上所述的本专利技术的引物。优选的，所述的试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品、RNA提取试剂、反转录试剂、和SYBR Green I荧光定量反应液。本专利技术的技术方案五为，一种检测埃博拉病毒的荧光定量PCR方法，包括以下步骤I)提取待检样品的RNA ；2)将上述提取的RNA反转录成cDNA ；3)将上述cDNA加入荧光定量反应液中用实时荧光PCR仪进行扩增检测；4)通过比较待检样品和标准品的循环阈值而对待检样品的其实拷贝数进行定量。本专利技术的技术方案六为，一种埃博拉病毒NP基因的用途，其用于制备埃博拉病毒的遗传标记分子。本专利技术的技术方案七为，本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子，其特征在于，所述的遗传标记分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中连续的50?273个核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中连续的50?196个核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire?Ebola?virus?strain?Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范围内的核苷酸片段都是本专利技术保护的检测埃博拉病毒的遗传标记。
【技术特征摘要】
1.一种检测埃博拉病毒的遗传标记分子,其特征在于，所述的遗传标记分子是埃博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸中连续的50-273个核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸中连续的50-196个核苷酸，所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virus strain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。所有的埃博拉病毒NP基因等位基因在上述位置范围内的核苷酸片段都是本发明保护的检测埃博拉病毒的遗传标记。2.如权利要求1所述的的遗传标记分子，其特征在于，所述的遗传标记分子是博拉病毒NP基因的第857位至第1130位所示序列的核苷酸，或者是埃博拉病毒NP基因的第878位至第1074位所示序列的核苷酸,所述的位置是指在埃博拉病毒株Zaire Ebola virusstrain Mayinga的NCBI登录号AF499101.1所示NP基因上位置。3.—种检测埃博拉病毒的遗传标记分子的引物对，其特征在于，所述的引物长度25-38 个核苷酸，且一个与 SEQ ID NO U SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :3、SEQ ID NO :4、或 SEQID NO :5 所示序列相同，另一个相应的与 SEQID NO USEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ IDNO :4、或SEQ ID N0:5所示序列互补，并且扩增产物的长度为50-300bp。4.一种检测埃博拉病毒的引物对，其特征在于，该引物对中，引物长度15-30bp，其中一个引物含有一到两个简并碱基，该简并碱...
【专利技术属性】
技术研发人员：马志永，史子学，魏建超，邵东华，王少辉，李蓓蓓，刘阳，王宗尧，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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