一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法。所述试剂盒包括反应液I，反应液II，反应液III。所述的反应液I包括PCR缓冲体系及酶，反应液II包括ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，反应液III包括NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相应荧光探针。所述试剂盒及方法能快速、灵敏、特性检测出与临床5类抗高血压要求相关基因的多态性。

A Kit and Method for Polymorphism Detection of Precision Drug-related Genes in Hypertension

【技术实现步骤摘要】
一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒及方法。
技术介绍
原发性高血压病是最常见的慢性疾病之一，是导致冠心病、脑卒中等心血管疾病的重要危险因子，大量的研究证明，原发性高血压病主要受遗传因素和环境因素的共同影响。目前临床常用的降压药物包括利尿剂、β肾上腺素受体阻滞剂、钙拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和α肾上腺素受体阻滞剂，然而，在临床治疗高血压的药物在个体反应差异十分普遍，主要原因是由于与药物相关的药物代谢酶和受体发生了遗传变异。CYP2D6在肝脏总CYP中仅占1-2％，但经其催化代谢的药物多达80多种，不同个体CYP2D6的活性最大可相差1000倍。在中国人群中最常见的多态性为CYP2D6*10，约51.6％的中国人携带此遗传变异。该多态性导致CYP2D6的酶活性降低，且极其不稳定，从而影响药物代谢。β肾上腺素受体属于G蛋白偶联受体超家族，由ADRB1基因编码，该基因存在多态性。研究表明ADRB1基因G1165C多态性与高血压药物治疗相关，使用美托洛尔、卡维地洛等治疗后，C1165纯合子个体有效率更高。血管紧张素转换酶是肾素-血管紧张素系统的关键酶，由ACE基因编码，该基因定位于17号染色体长臂2区3带，序列长21kb。ACE基因存在多种遗传多态性，其中第16内含子中存在的287bp的Alu插入片段(I)和缺失片段(D)的多态性与高血压药物治疗相关，研究表明DD纯合型个体使用贝那普利和福辛普利的疗效显著，II纯合型个体使用依那普利和咪达普利的疗效显著，ID杂合型个体使用血管紧张素抑制剂类药物治疗，均有效。新型利尿剂吲达帕胺(寿比山，indapmide)的上市，使利尿剂在高血压病的治疗地位又有新的提高，它的特点是常用剂量仅表现为轻微的利尿作用，主要表现为血管扩张作用，降压有效率在80％左右，且不存在传统利尿剂的代谢异常副作用，已在临床广泛应用。心房钠尿肽前体A(natriureticpeptideprecursorA，NPPA)是研究多种疾病遗传易感性的“候选基因”，位于人染色体1p36，编码ANP的前体。ANP作为一种利尿剂控制细胞外液量和电解质的平衡，而提高ANP水平可引起低血压。研究表明ANP(以及NPPA基因)与多种心脑血管疾病相关，如脑卒中、心力衰竭、左心房肥厚及高血压等。NPPAG664A是位于基因1号外显子上的单核苷酸突变(G/A)，使ANP前体蛋白第7位氨基酸变为甲硫氨酸，导致ANP活性降低。细胞色素氧化酶P450(CYP2C9)是人类肝脏中一类重要的药物代谢酶，约占人类肝中CYP酶总量的20％。CYP2C9等位基因的分布具有明显的人群、种族和地域差异，中国人群中，主要突变型基因为CYP2C9*3，是在第7个外显子第1075位发生A>C突变，造成CYP2C9多肽链上的第359位异亮氨酸突变成亮氨酸(Ile359>Leu359)，其等位基因频率为1.0-3.5％。洛沙坦、厄贝沙坦等沙坦类是常用的降血压药物，是一类有效的血管紧张素受体拮抗药，它主要由CYP2C9代谢，研究显示，沙坦类药物在体内主要由CYP2C9代谢，多态性CYP2C9*3的突变致使酶活性显著下降，毒性增加，疗效降低。临床研究表明，CYP2C9*3突变可导致洛沙坦降压效果减弱；CYP2C9*3突变可增加缬沙坦和厄贝沙坦的血药浓度，导致缬沙坦和厄贝沙坦降压效果增强。因此，当高血压患者选择沙坦类药物时，应该先对CYP2C9进行基因检测，根据CYP2C9*3的基因型选择沙坦类药物。血管紧张素II受体拮抗剂(AngiotensinIIreceptorantagonists)是一类作用于肾素-血管紧张素系统的药物，主要应用于治疗高血压、糖尿病肾病和充血性心力衰竭。I型血管紧张素II受体(AngiotensinIIreceptortype1，AGTR1)是血管紧张素II(angiotensin，AngII)的受体，主要分布于血管平滑肌细胞上，介导AngII绝大多数生物学作用。它是肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensinsystem，RAS)的组成部分，对高血压的发生及药物治疗具有重要意义。人类AGTR1基因位于3q21-25，仅含1个外显子，无内含子区域。研究发现，AGTR1基因多态性中，T573C，A1166C及A1062G替换的频率最高，A1166C基因型的患者在使用洛沙坦和坎地沙坦时呈现更显著的血压反应。高血压患者对血管紧张素II受体阻断药(如氯沙坦、依贝沙坦、替米沙坦等)的药物敏感性如下：A1166A患者药物敏感性正常，建议使用常规剂量；A1166C患者药物敏感性升高，建议降低剂量；C1166C患者药物敏感性升高，建议降低剂量。钙离子拮抗剂是通过阻滞钙通道来降低血压的化学制剂。它可以选择性抑制Ca2+经细胞膜上的钙通道进入细胞内，其通过扩张血管和负性肌力，松弛血管平滑肌，减少末梢血管阻力，从而起到降压作用。细胞色素P450(CytochromeP450，CYP)是一大类药物代谢酶，参与许多药物、生物异源性物质和内源性物质的代谢。CYP3A5主要在成人的肝脏和小肠表达，其表达具有明显的多态性。CYP3A5的基因突变是产生酶活性差异的最主要原因，其中CYP3A5*3在intron3(6959A>G)的突变引起可变剪切，产生了不稳定的蛋白质，从而使得突变性纯合子个体，即其携带基因CYP3A5*3/*3的人不表达CYP3A5。研究显示，钙拮抗剂类药物受CYP3A5*3基因多态性影响较大，含有突变基因型患者，药物毒副作用增加。基因多态性检测方法很多，最常见的包括测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ARMS、TaqmanPCR、ME-PCR、基因芯片等。这些方法不仅操作复杂，检测周期长，而且影响检测结果因素很多，不易控制，难以满足临床试剂检测的要求，目前只在科研领域进行。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于针对现有技术的不足，提供一种快速、精准系统地检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒及方法。为解决上述的问题，本专利技术采用以下技术方案：一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，试剂盒包括反应液I，反应液II，反应液III，阳性对照品，阴性对照品。所述的反应液I包括PCR缓冲体系及酶，反应液II包括ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，反应液III包括NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相应荧光探针，阳性对照品为ACE、CYP2D6、ADRB1、NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9七个基因的杂合型质粒，阴性对照品为不含目标靶基因的Tris盐。所述的反应液I包含10*taqbufferI，5*taqbufferII，HotstartTaq酶，UDG酶，dNTP，dUTP，增强剂；所述的10*taqbufferI包含200mMTris-HCl(pH8.4)，200mMKCl，100mM(NH4)2SO4，15mMMgCl2；所述的5*taqbufferII包含20mMMgSO4，所述的增强剂为包含0.5M甜菜碱、1％(V/V本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，其特征在于，包括反应液I，反应液II，反应液III，阳性对照品，阴性对照品；其中，所述的反应液I包含PCR缓冲体系、增强剂及酶，所述的反应液II包括ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，所述的反应液III包括NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相应荧光探针，所述的阳性对照品为ACE、CYP2D6、ADRB1、NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9七个基因的杂合型质粒，所述的阴性对照品为不含目标靶基因的Tris盐。

【技术特征摘要】
1.一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，其特征在于，包括反应液I，反应液II，反应液III，阳性对照品，阴性对照品；其中，所述的反应液I包含PCR缓冲体系、增强剂及酶，所述的反应液II包括ACE、CYP2D6、ADRB1基因检测引物及相应荧光探针，所述的反应液III包括NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9基因检测引物及相应荧光探针，所述的阳性对照品为ACE、CYP2D6、ADRB1、NPPA、AGTR1、CYP3A5、CYP2C9七个基因的杂合型质粒，所述的阴性对照品为不含目标靶基因的Tris盐。2.如权利要求1所述的一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液I包含10*taqbufferI，5*taqbufferII，HotstartTaq酶，UDG酶，dNTP，dUTP，增强剂；所述的10*taqbufferI包含200mMTris-HCl(pH8.4)，200mMKCl，100mM(NH4)2SO4，15mMMgCl2；所述的5*taqbufferII包含20mMMgSO4，所述的增强剂为包含0.5M甜菜碱、1％(V/V)甲酰胺、3％(V/V)甘油和0.2mg/mlBSA的混合物。3.如权利要求1所述的一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液II包含以下检测引物及荧光探针：ACEF1：TTTCTCTAGACCTGCTGCCTATACACER1：AGCTCAGAGAATTTCAGAGCTGACEP：CTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGG，5端标记ROX，3端标记BHQ2；D6F1：CCTCCCTCACCTGGTCGAAGCD6R1：TTCCTGCTCCTGGTGGACCTGD6P：CTGCACGCTACTCACCAGGCCC，5端标记FAM，3端标记BHQ1；B1F1：GCCTTCAACCCCATCATCTB1R1：GTCGTCGTCGTCGTCCGAB1P：TTCCAGCGACTGCTCTGCT，5端标记HEX，3端标记BHQ1。4.如权利要求3所述的一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液II中检测引物的比例为：ACEF1：ACER1＝2pmol：20pmol；D6F1：D6R1＝30pmol：3pmol；B1F1：B1R1＝2pmol：20pmol；三条检测探针的添加量均为5pmol。5.如权利要求1所述的一种高血压精准用药相关基因的多态性检测试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹华立，裘惠良，
申请(专利权)人：杭州千基生物科技有限公司，杭州博芯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33