一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用。本发明专利技术首次发现了CTSC基因表达与哮喘严重程度及难治性哮喘的发生发展相关，通过筛选难治性哮喘的非侵入式的诱导痰标志物，检测诱导痰中CTSC基因表达量，并将其用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂盒。本发明专利技术有助于难治性哮喘的进展评估，可实现难治性哮喘的早期无创诊断和哮喘的早期治疗，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。

A Screening Method for Detecting Markers of Refractory Asthma and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用。
技术介绍
难治性哮喘一种异质性疾病，采用传统的高剂量全身性皮质类固醇治疗或是口服类固醇或生物制剂等无法有效治疗控制该疾病。虽然难治性哮喘患者仅占所有哮喘患者的5％左右，但这些患者的生活质量严重受损，占据哮喘相关医疗费用的一半以上。因此，必须改进对难治性哮喘的诊断和监测以尽早筛选出难治性哮喘的易感个体并实施早期靶向干预治疗。现有传统的难治性哮喘的诊断依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量。但是，难治性哮喘的临床表现具有显著的异质性，传统的诊断方法不能早期、明确诊断难治性哮喘的易感性和严重程度。难治性哮喘主要的病理改变以气道的动态结构变化为特征，包括大气道和小气道并涉及支气管壁的所有层。这种病理性气道结构变化被统称为气道重塑，主要包括气道上皮损伤修复、基底膜增厚、成纤维细胞活化、平滑肌肥大迁移和血管生成。研究证实气道重塑是难治性哮喘表型的重要决定因素，其与肺功能不可逆转的损失有关。最重要的是，气道重塑已被证实在难治性哮喘的发病机制和治疗效果中发挥重要作用。但是难治性哮喘存在的气道重塑病理改变临床尚无明确的早期诊断依据和有效的临床治疗方法。气道上皮细胞是机体抵御外部环境的第一道屏障细胞，已被证实是气道重塑的起始和发展的核心。但是，难治性哮喘患者气道上皮细胞存在哪些气道重塑的关键差异基因仍不清楚。现有难治性哮喘的临床诊断依赖于临床表现、肺功能检查或峰流速测量。由于难治性哮喘的临床表现具有显著的异质性，传统的诊断方法不能早期、明确诊断难治性哮喘的易感性和严重程度。因此，寻找新的特异生物标志物将为难治性哮喘的诊断、病情监测和疗效评价提供一个新的、有应用前途、非侵入性的临床监测指标。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法及其应用，目的是通过筛选难治性哮喘的非侵入式的诱导痰标志物，检测诱导痰中CTSC基因表达量，并将其用于制备难治性哮喘的早期诊断试剂盒，有助于解释难治性哮喘的发病机理和进展评估，实现难治性哮喘的早期无创诊断和哮喘的早期治疗，具有创伤小、检测便捷、敏感性高、患者接受程度高的优势。本专利技术的难治性哮喘的检测标记物的筛选方法，所述的难治性哮喘的检测标记物是CTSC基因，按照以下步骤进行：(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中的原代气道上皮细胞：进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记，并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；(2)mRNA转录组测序分析：进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100-300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScriptIV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过AgencourtAMpureXP磁珠纯化，最终得到双链dscDNA；向纯化后的dscDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端dscDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；对于加上接头的文库，应用AgencourtSPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12-15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；对构建好的测序文库进行质检和定量；对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p-value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正；差异表达基因筛选参数：LogFC>1,adj.p-value<0.05；信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因；根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物；(4)采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达，最终确定CTSC是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。其中，所述的含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合包括外切酶、聚合酶和磷酸激酶，其中的外切酶活性消化3’端的单链突出，而聚合酶(Polymerase)活性补齐5’端的突出；同时磷酸激酶在5’末端加上后续连接反应必需的磷酸基团，再经过AgencourtAMpureXP磁珠纯化。所述的在末端修饰完成的双链cDNA两边3’末端加上单个腺苷酸“A”，防止cDNA片段之间的平末端自连，与下一步测序接头5’末端的单个“T”突出互补配对。所述的连接缓冲液中含有T4DNA连接酶，利用T4DNA连接酶将illumina测序接头连接至文库DNA两端，反应条件为30℃孵育10分钟。所述的文库片段大小筛选，采用两步法，先用SPRI磁珠去掉目标区域左侧小片段，再去掉位于目标片段区域右侧的大片段最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库，用于下一步的PCR扩增。所述的对构建好的测序文库进行质检和定量是应用Qubit准确定量文库浓度，用于准确混样，保证每个样本的数据量合适均衡，应用Agilent2100Bioanalyzer确定文库片段大小分布，评估适合上机。所述的对文库进行测序是采用illuminaHiseq平台，2×150的双端测序策略对文库进行测序。所述的PCR扩增采用蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定、免疫组化、流式类基因检测方法替代。一种难治性哮喘检测标记物，用于制备难治性哮喘的早期诊断的制剂、芯片或试剂盒。其中，所述难治性哮喘的早期诊断试剂盒中含有SYBRGreen聚合酶链式反应体系，用于扩增管家基因和CTSC基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包括：SYBRGreen荧光染料，PCR缓冲液和dNTPs。与现有技术相比，本专利技术的特点和有益效果是：本专利技术首次发现了CTSC基因表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述难治性哮喘检测标记物为CTSC基因，其按照以下步骤进行：(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中原代气道上皮细胞：进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；(2)mRNA转录组测序分析：①进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100‑300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScript IV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过Agencourt AMpure XP磁珠纯化，最终得到双链ds cDNA；②向纯化后的ds cDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端ds cDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；③对于加上接头的文库，应用Agencourt SPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；④用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12‑15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；⑤对构建好的测序文库进行质检和定量；⑥对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；⑦对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p‑value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：①筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini‑Hochberg方法对p值进行校正；②差异表达基因筛选参数：Log FC>1,adj.p‑value<0.05；③信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表达基因进行信号通路和富集分析，筛选出与气道重塑相关性最高的差异表达基因；④根据信号通路和富集分析结果，CTSC是与气道重塑的相关性最高的差异基因，可能是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物；(4)采用大样本量qPCR验证CTSC基因的差异表达，最终确定CTSC是难治性哮喘诊断与疗效评估的生物标志物。...

【技术特征摘要】
1.一种难治性哮喘检测标记物的筛选方法，其特征在于：所述难治性哮喘检测标记物为CTSC基因，其按照以下步骤进行：(1)收集临床明确诊断为哮喘病人及健康对照测试者的诱导痰中原代气道上皮细胞：进行细胞分类和活力检测，合格标准为上皮细胞<10个/低倍镜视野，白细胞>25个/低倍镜视野，细胞存活率>40％，筛选鉴定细胞，采用免疫磁珠分选法进行标记并进一步筛选纯化原代气道上皮细胞；(2)mRNA转录组测序分析：①进一步筛选纯化后，加入洗脱、片段化和随机引物组成的缓冲液，将磁珠94℃高温孵育，洗脱结合的mRNA同时进行热断裂，使片段分布在100-300bp之间；以片段化且结合了随机逆转录引物的短片段mRNA为模板，在Invitrogen逆转录酶SuperScriptIV的作用下进行第一链cDNA的合成，向合成一链cDNA的体系中加入二链合成预混体系，水解消化RNA/cDNA杂合链上的RNA，并以一链cDNA为模板，DNA聚合酶合成二链cDNA，经过AgencourtAMpureXP磁珠纯化，最终得到双链dscDNA；②向纯化后的dscDNA加入末端补齐体系，其是含有修复cDNA两端不规则末端的酶组合，最终得到5’端含有磷酸基团的平末端dscDNA短片段文库；向上述体系中加入3’末端加“A”缓冲反应体系；向上述反应体系中加入连接缓冲液和双链测序接头；③对于加上接头的文库，应用AgencourtSPRIselect核酸片段筛选试剂盒在纯化文库的同时，进行片段大小筛选，最终筛选出片段峰值在300bp的原始文库；④用聚合酶放大原始文库，PCR扩增循环数控制在12-15之间，放大后的文库经过磁珠纯化即成为可以上机的测序文库；⑤对构建好的测序文库进行质检和定量；⑥对于质检合格的文库经过稀释后按等摩尔数对多个样品进行混样上机，对文库进行测序；⑦对测序结果进行生物信息学分析，使用tophat2将质量控制后的序列和参考基因组进行比对，利用cufflinks的分析流程对已知的基因和转录本进行表达定量，利用cuffdiff软件分析差异表达基因，当adj.p-value<0.05时，认为mRNA显著差异表达；(3)利用健康对照、非难治性哮喘及难治性哮喘患者气道上皮细胞的mRNA转录组测序数据进行差异基因分析，通过对差异基因进行信号通路和富集分析，明确与气道重塑相关性最高的差异基因，确定难治性哮喘的候选生物标志物：①筛选差异表达基因：通过R语言筛选相对于健康对照与非难治性哮喘，在难治性哮喘患者气道上皮细胞差异表达的基因，并通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正；②差异表达基因筛选参数：LogFC>1,adj.p-value<0.05；③信号通路和富集分析：通过metascape.org在线网站对差异表...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘持，秦岭，袁琳，秦晓群，向阳，瞿湘萍，刘惠君，杜茜子，伍梦萍，杨雨，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43