一种核酸扩增纸基可视化检测平台制造技术

本发明专利技术提供了一种核酸扩增纸基可视化检测平台，将扩增产物和核酸染料直接加到纸基材料上，仅仅使用一个小小的紫外灯就能实现阴阳性结果的判断。通过本发明专利技术的技术方案，基于硅胶膜内的扩增反应加入SYBRGreen I染料，利用简单的紫外光，进行可视化判断，可以方便直观地得到“是与否”的答案。硅胶膜是DNA和SYBRGreen I信号显示的相容性基质，能够为核酸扩增检测提供了一个有效的平台，使用硅胶膜不会对扩增过程产生干扰，该扩增平台的检测灵敏度和使用荧光定量PCR的检测灵敏度一直，且扩增产物的大小不受影响。硅胶膜不仅提供了结果判读平台，其多孔径性质为反应提供更多的空间，使得反应组分充分混合和扩散，为扩增反应提供良好的容器。

A paper-based visual detection platform for nucleic acid amplification

【技术实现步骤摘要】
一种核酸扩增纸基可视化检测平台
本专利技术涉及核酸检测
，具体而言，特别涉及一种核酸扩增纸基可视化检测平台。
技术介绍
各种病原菌的存在是全世界最严重的健康问题之一。为了防止大规模的暴发，早期发现病原菌和诊断疾病至关重要。核酸扩增与实时荧光检测在分子诊断领域发挥着重要的作用。然而，这种检测方法往往需要大型的荧光扩增仪，不能满足现场或即时检测（POCT）的需求。SYBRGreenI染料已广泛应用于实时定量核酸检测方法的开发，如实时荧光定量PCR（RT-PCR）或实时荧光环介导等温扩增反应（RT-LAMP）等，在分析和诊断应用中表现出良好的性能。尽管SYBRGreenI染料具有良好的性能，但在POCT中却很少使用。近年来，纸基材料因其价格便宜、方便携带、材料容易得到且具有良好的生物相容性而被广泛应用于分子诊断领域。然而，基于纸基材料的扩增和检测一体化平台却鲜有报道。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种核酸扩增纸基可视化检测平台。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种核酸扩增纸基可视化检测平台，其中，检测平台包括以下步骤：步骤（1）：将纸基材料用打孔器裁成直径3mm的大小的原片，并置于0.2mL离心管盖上；步骤（2）：将SEA扩增反应液直接加步骤（1）中纸基材料原片上，分别置于金属浴上加热反应；步骤（3）：向步骤（2）中的反应中加入10倍梯度稀释的副溶血性弧菌基因组DNA作为靶标；步骤（4）：将SEA反应液也直接加入0.2mLPCR管里，并置于金属浴上加热；步骤（5）：待步骤（4）反应结束后，往不同的纸基材料原片或者管里加入1µL的SYBRGreenI染料，得到的扩增产物直接置于紫外灯下激发并拍照记录；步骤（6）：另取步骤（1）中纸基材料原片，加入15µL2倍梯度稀释的pMD18-T载体DNA和1µL的SYBRGreenI染料加到材料表面，将原片直接置于紫外灯下激发并拍照记录；步骤（7）：将步骤（5）和步骤（6）得到的图像进行灰度化处理，并用ImageJ软件进行分析，记录平均像素值作为信号强度；步骤（8）：将空白样品检测结果的平均值记录为噪声N，将含有副溶血性弧菌基因组DNA的样品检测结果记录为信号S，归一化强度计算为样本与空白之间的信噪比SNR值：SNR＝N/S；步骤（9）：将步骤（5）中的扩增产物直接进行12.5%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分析。作为优选方案，步骤（1）中的纸基材料为硅胶膜、硝酸纤维素膜、Whatman1号滤纸中的一种。作为优选方案，步骤（2）中的金属浴加热温度为63°C。作为优选方案，步骤（3）中的加入10倍梯度稀释的副溶血性弧菌基因组DNA范围在1.0×10-10到1.0×10-15M的10倍梯度稀释。作为优选方案，步骤（4）中的金属浴加热温度为63°C。本专利技术由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：（1）基于硅胶膜内的扩增反应加入SYBRGreenI染料，利用简单的紫外光，进行可视化判断，利用肉眼可以方便直观地得到“是与否”的答案，不需要大型仪器就可以实现结果的判读，可以用于现场检测。（2）硅胶膜是DNA和SYBRGreenI信号显示的相容性基质，能够为核酸扩增检测提供了一个有效的平台，使用硅胶膜不会对扩增过程产生干扰，该扩增平台的检测灵敏度和使用荧光定量PCR的检测灵敏度一直，且扩增产物的大小不受影响。（3）硅胶膜不仅提供了结果判读平台，其多孔径性质为反应提供更多的空间，使得反应组分充分混合和扩散，为扩增反应提供良好的容器。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为PMD18-T载体DNA和SYBRGreenI染料在不同膜上的荧光强度；图2为PMD18-T载体DNA和SYBRGreenI染料在不同膜上的荧光信号的信噪比SNR值；图3为基于SYBRGreenI染料和纸基材料的核酸扩增可视化检测平台对SEA扩增反应的荧光强度；图4为基于SYBRGreenI染料和纸基材料的核酸扩增可视化检测平台对SEA扩增反应的荧光信号的信噪比SNR值；图5为硅胶膜材料上的SEA扩增反应产物鉴定。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本专利技术的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。下面结合图1至图5对本专利技术的实施例的核酸扩增纸基可视化检测平台进行具体说明。实施例中使用的试剂：SEA等温扩增试剂盒购自青岛耐德生物技术有限公司。SEA扩增反应液来自该试剂盒。基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。该试剂盒用于副溶血性弧菌基因组的提取并用于后续的SEA扩增反应。核酸分子标准条带和loading缓冲液购自大连宝生物。SYBRGreenI染料购自Invitrogen公司，使用时SYBRGreenI染料与SEA扩增反应液按1:15比例加到硅胶膜上。除另有说明外，所有其他化学品均为分析级。实施例1将硅胶膜用打孔器裁成直径3mm的大小的圆片，并置于0.2mL离心管盖上；取纸基材料圆片，将15µL2倍梯度稀释的pMD18-T载体DNA和1µL的SYBRGreenI染料加到材料表面，将圆片直接置于紫外灯下激发并拍照记录；将得到的图像进行灰度化处理，并用ImageJ软件进行分析，记录平均像素值作为信号强度。将空白样品的平均值记录为N（噪声），将给定样本的DNA样本的平均值记录为S（信号）。归一化强度计算为样本与空白之间的信噪比（SNR）值：SNR＝N/S。实施例2将硝酸纤维素膜用打孔器裁成直径3mm的大小的圆片，并置于0.2mL离心管盖上；取纸基材料圆片，加入15µL2倍梯度稀释的pMD18-T载体DNA和1µL的SYBRGreenI染料加到材料表面，将圆片直接置于紫外灯下激发并拍照记录；将得到的图像进行灰度化处理，并用ImageJ软件进行分析，记录平均像素值作为信号强度。将空白样品的平均值记录为N（噪声），将给定样本的DNA样本的平均值记录为S（信号）。归一化强度计算为样本与空白之间的信噪比（SNR）值：SNR＝N/S。实施例3将Whatman1号滤纸用打孔器裁成直径3mm的大小的圆片，并置于0.2mL离心管盖上；取纸基材料圆片，加入15µL2倍梯度稀释的pMD18-T载体DNA和1µL的SYBRGreenI染料加到材料表面，将圆片直接置于紫外灯下激本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸扩增纸基可视化检测平台，其特征在于,所述检测平台包括以下步骤：/n步骤（1）：将纸基材料用打孔器裁成直径3 mm的大小的圆片，并置于0.2 mL离心管盖上；/n步骤（2）：将等温扩增扩增反应液直接加步骤（1）中纸基材料圆片上，分别置于金属浴上加热反应；/n步骤（3）：向步骤（2）中的反应中加入10倍梯度稀释的副溶血性弧菌基因组DNA作为靶标；/n步骤（4）：将等温扩增反应液也直接加入0.2 mL PCR管里，并置于金属浴上加热；/n步骤（5）：待步骤（4）反应结束后，往不同的纸基材料圆片或者管里加入1µL的SYBRGreen I染料，得到的扩增产物直接置于紫外灯下激发并拍照记录；/n步骤（6）：另取步骤（1）中纸基材料圆片，加入15 µL 2 倍梯度稀释的pMD 18-T载体DNA和1µL的SYBR Green I染料加到材料表面，将圆片直接置于紫外灯下激发并拍照记录；/n步骤（7）：将步骤（5）和步骤（6）得到的图像进行灰度化处理，并用ImageJ软件进行分析，记录平均像素值作为信号强度；/n步骤（8）：将空白样品检测结果的平均值记录为噪声N，将含有副溶血性弧菌基因组DNA的样品检测结果记录为信号S，归一化强度计算为样本与空白之间的信噪比SNR值：SNR＝N/S；/n步骤（9）：将步骤（5）中的扩增产物直接进行12.5%PAGE电泳分析。/n...

【技术特征摘要】
1.一种核酸扩增纸基可视化检测平台，其特征在于,所述检测平台包括以下步骤：
步骤（1）：将纸基材料用打孔器裁成直径3mm的大小的圆片，并置于0.2mL离心管盖上；
步骤（2）：将等温扩增扩增反应液直接加步骤（1）中纸基材料圆片上，分别置于金属浴上加热反应；
步骤（3）：向步骤（2）中的反应中加入10倍梯度稀释的副溶血性弧菌基因组DNA作为靶标；
步骤（4）：将等温扩增反应液也直接加入0.2mLPCR管里，并置于金属浴上加热；
步骤（5）：待步骤（4）反应结束后，往不同的纸基材料圆片或者管里加入1µL的SYBRGreenI染料，得到的扩增产物直接置于紫外灯下激发并拍照记录；
步骤（6）：另取步骤（1）中纸基材料圆片，加入15µL2倍梯度稀释的pMD18-T载体DNA和1µL的SYBRGreenI染料加到材料表面，将圆片直接置于紫外灯下激发并拍照记录；
步骤（7）：将步骤（5）和步骤（6）得到的图像进行灰度化处理，并用ImageJ软件进行分析，记录平均像素值作为信号强度；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀丹，马翠萍，焉春雨，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37