一种鸡粪便污染的微生物溯源方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡粪便污染的微生物溯源方法，涉及微生物溯源技术领域。包括引物组Ckmito1‑G、Ckmito1‑D、CkmitoN1‑G、CkmitoN1‑D、ND5‑F、ND5‑R和ND5‑P，还提供了基于上述引物组的试剂盒和检测方法。本发明专利技术解决了国内外无法对鸡粪便污染进行高度识别并定量的现状，该方法对鸡粪便污染的检测准确率高、特异性好且能够定量。

A microbial source tracing method for chicken feces pollution

【技术实现步骤摘要】
一种鸡粪便污染的微生物溯源方法
本专利技术涉及微生物溯源
，具体涉及一种鸡粪便污染的微生物溯源方法。
技术介绍
随着禽类养殖业的繁荣发展，鸡粪便的产生日益增加。鸡的粪便因雨水冲刷或人为管理不善，将会流入地表水中，对水体环境造成一定的污染。而且鸡粪便中含有大量的致病菌，可能会对人体健康造成一定的威胁。如何快速鉴别水体中是否存在鸡粪便污染，对水体和人类健康保护均具有重要的意义。微生物溯源是一种利用基因标记物特异性地区分来自不同动物粪便污染的技术。根据鸡粪源标记物能够特异性的识别来自鸡粪便的污染。但是，现有鸡粪源标记物要么无法对鸡粪便污染准确识别，要么不能对污染进行定量。另外，现有标记物大多没有在我国进行过验证，其在我国的适用性存在不确定性。以上这些因素对鸡粪源标记物在我国的实际应用造成了困难。因此，专利技术一种适用于我国的且能够特异性检测鸡粪源污染物并定量的微生物溯源方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种鸡粪便污染的微生物溯源方法。将两种在分别在鸡粪便污染定性和定量方面表现较好的标记物进行结合使用，在得到高准确的定性效果的同时也获得定量效果，并适用于我国的实际应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种鸡粪便污染的微生物溯源引物组，包括Ckmito1-G、Ckmito1-D、CkmitoN1-G、CkmitoN1-D、ND5-F、ND5-R和ND5-P，引物序列为：Ckmito1-G：5’-ACCCTATTTGACTCCCTCAA-3’，SEQIDNO:1所示；Ckmito1-D：5’-ATGTCGACCAGGGGTTTATG-3’，SEQIDNO:2所示；CkmitoN1-G：5’-CCCCCACACTAACAAGCAAT-3’，SEQIDNO:3所示；CkmitoN1-D：5’-GGTTGTAAGGTGGTCGTGAT-3’，SEQIDNO:4所示；ND5-F：5’-ACCTCCCCCAACTAGC-3’，SEQIDNO:5所示；ND5-R：5’-TTGCCAATGGTTAGGCAGGAG-3’，SEQIDNO:6所示；ND5-P：5’-TCAACCCATGCCTTCTT-3’，SEQIDNO:7所示；其中，ND5-P的5′端标记荧光染料6-FAM、3′端标记MGB基团。本专利技术还提供了一种基于上述引物组的试剂盒，包括反应液、工作标准品和阳性对照。优选的：反应液包括包括10×ExTaqBuffer、2×TaqManEnvironmentalMasterMix2.0、dNTPMixture、ExTaq酶、上游引物、下游引物、探针和无菌水。本专利技术还提供了一种鸡粪便污染的微生物溯源方法，包括下列步骤：(1)巢式PCR：(S1)以Ckmito1-G/D为引物，对检测样品进行第一步PCR反应；(S2)以第一步PCR反应中显阳性的扩增产物为模板，以CkmitoN1-G/D为引物进行第二步PCR反应，确定显阳性的DNA样品；(2)荧光定量PCR反应，对步骤(S2)显阳性的粪便DNA样品进行定量测定。优选的：步骤(1)第一步和第二步PCR反应体系：4μL10×ExTaqBuffer、2μLdNTPMixture、0.35μL5U/μLExTaq酶、终浓度为200nM的上游引物、终浓度为200nM的下游引物、1μL的DNA模板，加无菌水至25μL。优选的：步骤(1)第一步和第二步PCR反应条件如下：94℃预变性5min；95℃变性40s,55℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环。循环结束后保持72℃共6min。反应结束后，将目的片段使用1％的琼脂糖在恒压100V，电泳时间40min的条件下进行电泳，随后观察目的条带是否存在进而判断是否存在污染物。优选的：步骤(2)荧光定量PCR反应体系：10μL2×TaqManEnvironmentalMasterMix2.0，终浓度为900nM的上游引物ND5-F、终浓度为900nM的下游引物ND5-R、终浓度为250nM的探针ND5-P、2μL的DNA模板，加无菌水至20μL。优选的：步骤(2)荧光定量PCR反应条件如下：50℃预变性2min；95℃预变性10min；95℃变性15s,60℃退火和延伸1min，共40个循环。检测信号在退火和延伸阶段收集。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种鸡粪便污染的微生物溯源方法，取的技术效果为解决了国内外无法对鸡粪便污染进行高度识别并定量的现状，使用本专利技术的引物组和检测顺序，对鸡粪便污染的检测准确率高、特异性好且能够定量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术中使用的标记物ND5-CD和qBac265R-HU对75个鸡粪便样品进行定量检测的结果示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种鸡粪便污染的微生物溯源方法。所涉及的单一药品、组分均为市售渠道采购，例如，10×ExTaqBuffer(Mg2+plus)来源为TakaraBio,Otsu,Japan；dNTPMixture来源为TakaraBio,Otsu,Japan；QIAampDNAStoolMiniKit来源为QIAGEN,Hilden,Germany；试剂盒OneStepTMPCRInhibitorRemovalKit来源为ZymoResearchCorps,Irvine,CA,USA等，未提及的方法为常规实验方法，未提及的试验设备为常规实验设备，对其品牌不做限定，在此不再一一赘述。实施例1样品的采集为使样品具有代表性，共在内蒙古、北京、河南、江西和广东5个地区采集了共计148份样品，包括75份鸡粪便样品(采集自25个不同的养殖场)和73份非鸡粪便样品。其中，73份非鸡粪便样品包括10份鸭粪便样品、14份鹅粪便样品、6份鸽子粪便样品、10份猪粪便样品、6份狗粪便样品、6份马粪便样品、5份驴粪便样品、6份牛粪便样品和10份羊粪便样品。样品采集完成后，使用干冰将样品运送回实验室，并保存于-80℃冰箱内。实施例2DNA的提取①取180-220mg粪便样品，按照说明书要求使用QIAampDNAStoolMi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡粪便污染的微生物溯源引物组，其特征在于，包括Ckmito1-G、Ckmito1-D、CkmitoN1-G、CkmitoN1-D、ND5-F、ND5-R和ND5-P，引物序列为：/nCkmito1-G：5’-ACCCTATTTGACTCCCTCAA-3’，SEQ ID NO:1所示；/nCkmito1-D：5’-ATGTCGACCAGGGGTTTATG-3’，SEQ ID NO:2所示；/nCkmitoN1-G：5’-CCCCCACACTAACAAGCAAT-3’，SEQ ID NO:3所示；/nCkmitoN1-D：5’-GGTTGTAAGGTGGTCGTGAT-3’，SEQ ID NO:4所示；/nND5-F：5’-ACCTCCCCCAACTAGC-3’，SEQ ID NO:5所示；/nND5-R：5’-TTGCCAATGGTTAGGCAGGAG-3’，SEQ ID NO:6所示；/nND5-P：5’-TCAACCCATGCCTTCTT-3’，SEQ ID NO:7所示；/n其中，ND5-P的5′端标记荧光染料6-FAM、3′端标记MGB基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡粪便污染的微生物溯源引物组，其特征在于，包括Ckmito1-G、Ckmito1-D、CkmitoN1-G、CkmitoN1-D、ND5-F、ND5-R和ND5-P，引物序列为：
Ckmito1-G：5’-ACCCTATTTGACTCCCTCAA-3’，SEQIDNO:1所示；
Ckmito1-D：5’-ATGTCGACCAGGGGTTTATG-3’，SEQIDNO:2所示；
CkmitoN1-G：5’-CCCCCACACTAACAAGCAAT-3’，SEQIDNO:3所示；
CkmitoN1-D：5’-GGTTGTAAGGTGGTCGTGAT-3’，SEQIDNO:4所示；
ND5-F：5’-ACCTCCCCCAACTAGC-3’，SEQIDNO:5所示；
ND5-R：5’-TTGCCAATGGTTAGGCAGGAG-3’，SEQIDNO:6所示；
ND5-P：5’-TCAACCCATGCCTTCTT-3’，SEQIDNO:7所示；
其中，ND5-P的5′端标记荧光染料6-FAM、3′端标记MGB基团。


2.一种基于权利要求1的引物组的试剂盒，包括反应液、工作标准品和阳性对照。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括10×ExTaqBuffer、2×TaqManEnvironmentalMasterMix2.0、dNTPMixture、ExTaq酶、上游引物、下游引物、探针和无菌水。


4.一种鸡粪便污染的微生物溯源方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)巢式PCR：
(S1)以C...

【专利技术属性】
技术研发人员：余志晟，梁红霞，张洪勋，刘如铟，
申请(专利权)人：中国科学院大学，
类型：发明
国别省市：北京;11