早期膀胱癌的多靶标检测方法技术

本发明专利技术早期膀胱癌的多靶标检测方法，属于生物检测技术领域。包括下述步骤：(1)提取患者尿液中所含的DNA；(2)对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；(3)通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因；(4)以步骤(3)中的CT值来判定患者是否为早期膀胱癌。本发明专利技术具有以下优点：采用多个生物标志物基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性；根据多个生物标志物基因设计了特异性引物。

【技术实现步骤摘要】
早期膀胱癌的多靶标检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及早期膀胱癌的多靶标检测方法。
技术介绍
膀胱癌在全球发病率位列第五。在大多数情况下，约75％的患者处于Ta或T1期，即非肌肉浸润性膀胱癌(non-muscleinvasivebladdercancer，NMIBC),而剩下的25％肿瘤处于肌肉入侵阶段T2-T4癌症(muscleinvasivebladdercancer，MIBC)。约60％-70％的NMIBC肿瘤患者的切除后3年内复发[1-3]。复发病人中大部分会周期性复发而癌症级别不会进一步恶化，但约25％的病人会发展为MIBC。由于高复发率和恶化的风险，早诊断，早治疗，频繁的长期监测对于膀胱癌患者提高生存率十分重要。传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点，研究报道很多，目前已有部分标记物已在临床上使用，如下表(Cheungetal.BMCMedicine2013,11:13)膀胱癌像所有的癌症一样，是与相关的基因组上的改变相关的。在表观遗传学上的改变比如DNA甲基化和组蛋白修饰等也经常在肿瘤中被观察到。事实上,DNA甲基化已被证明与各种癌症包括膀胱癌的发展有关。DNA甲基化异常可通过影响染色质结构及癌基因和抑癌基因的表达而参与肿瘤形成。因此，这种特定基因的DNA甲基化可以用来作为生物标志物对膀胱癌进行检测和监控。甲基化特异性荧光定量PCR(QuantitativeMethylation-specificPolymeraseChainReaction，qMSP)的技术首先由Herman等于1996年描述。它利用DNA经亚硫酸氢钠处理后，甲基化和非甲基化DNA单链序列的差异来设计不同的PCR引物。MSP是目前最敏感的技术，能发现0.1％的甲基化DNA(～50pg)。相比现有的在临床上使用的生物标记物，甲基化生物标记物具有高灵敏高特异性的特点。目前国内还没有通过检测甲基化生物标记物来做肿瘤相关专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了早期膀胱癌的多靶标检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：1、早期膀胱癌的多靶标检测方法，包括下述步骤：(1)、提取患者尿液中所含的DNA；(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因；(4)、以步骤(3)中标志物基因的相对甲基化水平值与其检出限之间的大小判定患者是否为早期膀胱癌，当任何一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限，该患者为早期膀胱癌患者。2、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(1)中的DNA总量>500纳克，片段大小>10kb。3、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(3)中的针对ALU-C4的上游引物序列为SEQNo.1，下游引物序列为SEQNo.2；针对EOMES的上游引物序列为SEQNo.3，下游引物序列为SEQNo.4；针对GDF15的上游引物序列为SEQNo.5，下游引物序列为SEQNo.6；针对NID2的上游引物序列为SEQNo.7，下游引物序列为SEQNo.8；针对PCDH17的上游引物序列为SEQNo.9，下游引物序列为SEQNo.10；针对POU4F2的上游引物序列为SEQNo.11，下游引物序列为SEQNo.12；针对TCF21的上游引物序列为SEQNo.13，下游引物序列为SEQNo.14；针对ZNF154的上游引物序列为SEQNo.15，下游引物序列为SEQNo.16。4、根据权利要求1或3所述的早期癌症的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(3)中针对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154和ALU-C4的引物联合使用。5、根据权利要求1所述的早期膀胱癌的多靶标检测方法，其特征在于，步骤(4)的具体过程为：(a)、用针对ALU-C4、EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每对引物纯化后的qPCR产物制作标准曲线，做出每对引物的标准曲线；通过标准曲线定出每个基因的实际甲基化的拷贝数；(b)、将(a)得到的每个拷贝数代入公式一，计算出每一个标志物基因的相对甲基化水平值；公式一：相对甲基化水平值＝[(gene/ALU)sample/(gene/ALU)Standard]×1000(c)、步骤(b)所得的标志物基因的相对甲基化水平值高于对应标志物基因的检出限判定为阳性，等于或低于检出限判定为阴性；任一标志物基因为阳性则判定该患者为早期膀胱癌患者。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术的检测方法在检测过程中采用多个生物标志物基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测的敏感性和特异性。2、本专利技术的检测方法根据多个生物标志物基因设计了特异性引物。3、本专利采用尿液作为检测样本，无创伤，取样方便。4、检测时间短，从采样到结果输出可在1天内完成。附图说明：1、图1为ALU-C4的标准曲线；2、图2为EOMES的标准曲线；3、图3为GDF15的标准曲线；4、图4为NID2的标准曲线；5、图5为PCDH17的标准曲线；6、图6为POU4F2的标准曲线；7、图7为TCF21的标准曲线；8、图8为ZNF154的标准曲线；9、图9为EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的相对甲基化水平。具体实施方式：为使本专利技术的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本专利技术早期癌症的多靶标检测方法作进一步的说明。实施例1：早期癌症的多靶标检测方法：一、样本来源：对30个膀胱癌患者和30个正常人的尿液4个尿路炎症尿液DNA样本进行了检测。膀胱癌患者样本来自于深圳市第二人民医院泌尿外科，正常人样本来自于自愿者尿液样本，样本信息见表1所示，表164例样本信息二、DNA的提取及检测：1、DNA提取：取得尿液样本后按照体积比尿液:保存液＝4:1加入尿液保存液，混匀后迅速冻存在-20度或-80度。需提取时，温浴至尿液澄清，用低温离心机4℃，800g离心15min后，去上清，留沉淀进行提取。采用天根微量样品基因组DNA提取试剂盒(DP316)对沉淀物进行DNA提取，提取流程参照试剂盒说明书。2、样品检测：(1)、浓度检测方法：QubitFluorometer检测方法按照Quant-itdsDNAHSAssayKit的说明书中步骤进行。注意每天第一次使用Qubit时，需要先配制标准曲线，且要用2ulstandard2#作为阳性对照，检验标准曲线的准确性，只有当standard2#检测的浓度在下面范围内标准曲线才能使用。Qubit本文档来自技高网...

【技术保护点】
早期膀胱癌的多靶标检测方法，包括下述步骤：(1)、提取患者尿液中所含的DNA；(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU‑C4作为内参基因；(4)、以步骤(3)中标志物基因的相对甲基化水平值与其检出限之间的大小判定患者是否为早期膀胱癌，当任何一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限，该患者为早期膀胱癌患者。

【技术特征摘要】
1.用于检测多个标志物基因的试剂在制备用于检测早期膀胱癌试剂的应用，包括下述步骤：(1)、提取膀胱癌患者尿液中所含的DNA；(2)、对步骤(1)获得的DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；(3)、通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测，以ALU-C4作为内参基因；(4)、在膀胱癌患者中步骤(3)所述的七个标志物基因中至少一个标志物基因的相对甲基化水平值高于其检出限；所述步骤(3)中的针对ALU-C4的上游引物序列为SEQNo.1，下游引物序列为SEQNo.2；针对EOMES的上游引物序列为SEQNo.3，下游引物序列为SEQNo.4；针对GDF15的上游引物序列为SEQNo.5，下游引物序列为SEQNo.6；针对NID2的上游引物序列为SEQNo.7，下游引物序列为SEQNo.8；针对PCDH17的上游引物序列为SEQNo.9，下游引物序列为SEQNo.10；针对POU4F2的上游引物序列为SEQNo.11，下游引物序列为SEQNo.12；针对TCF21的上游引物序列为SEQNo.13，下游引物序列为SEQNo.14；针对ZNF154的上游引物序列为SEQNo.15，下游引物序列为SEQNo.16。...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡志明，吴松，于源，叶睿，李巧玲，王永强，
申请(专利权)人：蔡志明，吴松，
类型：发明
国别省市：广东;44