本发明专利技术公开了一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，该内参为单独的hsa-miR-193a-5p，或：hsa-miR-193a-5p与hsa-miR-16-5p。本发明专利技术还公开了检测该内参的引物，包括检测hsa-miR-193a-5p（如SEQ?ID?NO：1～3所示）或/和hsa-miR-16-5p的引物（如SEQ?ID?NO：4～6所示），该内参及其引物可用于制备检测膀胱癌血清内参的试剂盒，用于膀胱癌血清miRNA内参的检测。
【技术实现步骤摘要】
—种用于膀胱癌血清m i RNA检测的内参及其检测引物与应用
本专利技术涉及一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参及其检测引物与应用，属于分子生物学检测
。
技术介绍
膀胱癌是一类多发的泌尿生殖系统肿瘤，其在我国男性中的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。在膀胱癌初诊患者中，约30%为易发生转移的侵袭性膀胱癌(MIBC)，而非侵袭性膀胱癌(匪IBC)患者中仍有30%会复发为侵袭性膀胱癌。早期诊断和治疗可提高膀胱癌病人的治疗效果并改善预后，因此寻找具有较高特异性和敏感性的实用诊断方法是十分必要的。目前，临床中用于诊断膀胱癌的方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学以及影像学方法等，其中，膀胱镜为诊断膀胱癌的常用方法，但其侵入性易导致膀胱及尿道损伤或感染等；尿脱落细胞学特异性高但其敏感性低且易受主观因素影响；影像学方法主要包括CT及超声检查，常用于膀胱癌诊断及术前分期，但其对膀胱内较小病变不易发现，难以用于早期诊断。因此，寻找特异性和敏感性高的早期诊断标志物，建立经济实用、安全可靠的血清学膀胱癌诊断方法成为目前的研究热点。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的单链非编码小RNA，由18~25个碱基组成，其通过与目的mRNA分子3’端非翻译区结合进而在转录后水平调控基因表达，由此影响细胞的增殖、分化及凋亡过程。有研究表明miRNA表达谱与肿瘤的起源和分期(stage)密切相关，提示其可作为肿瘤诊断标志物。2008年，中美科学家同步发现血液循环中稳定存在丰富的miRNA，且其性质稳定，对RNA酶、酸碱环境、长时间室温放置(> 24小时)及反复冻融均不敏感。此外，循环miRNA还有其作为肿瘤标志物的独特优势，其检测可精确定量且无需制备抗体，性价比高。不同的肿瘤具有各自特异的循环miRNA表达谱，而且其表达谱通常与肿瘤分期及分级密切相关。因此，检测循环miRNA可为肿瘤的无创性诊断与监测开辟新的途径。 目前，检测miRNA的技术已相当成熟，主要包括高通量测序技术、基因芯片技术以及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，其中前两者属于高通量方法，主要用于miRNA筛选， 对于所筛选出的miRNA进行准确测定则需要采用qRT-PCR技术。为得到准确的qRT-PCR结果，还需要采取标准化方法以消除实验误差并使不同实验室的结果具有可比性。常用的标准化方法主要有三种:一是在提取RNA时取等量的血清，二是在提取RNA之前向血清加入人工合成miRNA(如线虫-39，cel-miR-39)，三是采用一个或多个内源性分子作为检测血清 miRNA表达的内参。然而，取等量的血清很难保证在逆转录中加入的miRNA是等量的，而加入人工合成miRNA仅能控制在RNA提取以及cDNA合成过程中的实验误差，由此可以看出这两种方法都不能有效控制样本本身的生物学差异。与前两者不同的是，采用一个或多个内源性分子作为检测血清miRNA表达的内参不仅可以控制实验操作中的误差，还可以控制样本本身的生物学差异，具有独特的优势，因而成为业界所公认的最佳标准化方法。目前，在膀胱癌血清miRNA研究中，尚缺乏公认的较为稳定的内参分子，以往的研究者主要根据自身经验或者参考文献来选择内参分子，在不同的实验中选取的内参通常并不一致，因而制约了研究成果的转化和不同实验室之间研究成果的比较。因此，如果能够筛选出适用于膀胱癌血清miRNA检测的内参并研发出相应的试剂盒使之能够应用于科研领域，将极大地促进膀胱癌血清miRNA研究及科研成果的转化，对于膀胱癌的诊疗必将起到巨大的推动作用。
技术实现思路
针对上述现有技术，为解决现有技术中尚无一种稳定的膀胱癌血清miRNA内参分子的技术问题，本专利技术提供了一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，并提供了检测该内参的引物、专用试剂盒、检测方法，以及在诊断、检测膀胱癌中的应用，为膀胱癌血清miRNA 研究的实验数据提供了实用可靠的标准化依据。 本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，该内参为单独的hsa-miR-193a-5p，或: hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16_5p ；所述hsa-miR-193a-5p 的序列为:5’ -UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA-3’，如 SEQ ID NO:7所示；所述hsa-miR-16-5p 的序列为:5’ -UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’，如 SEQ ID NO: 8所示。检测上述用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的特异性引物，包括检测 hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，具体如下:(I)检测hsa-miR-193a_5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:hsa-miR-193a_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ；hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ；hsa-miR-193a-5p-R:5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3J ；(2)检测hsa-miR-16_5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:hsa-miR-16_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；hsa-miR-16-5p-F:5，-GCTAGCAGCACGTAAATA-3，；hsa-miR-16-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3?。上述用于膀胱癌血清miRNA检测的内参在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。上述检测用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的引物在制备诊断膀胱癌的试剂盒中的应用。一种检测膀胱癌血清miRNA内参的试剂盒，该试剂盒含有用于检测 hsa-miR-193a-5p的引物(如SEQ ID NO:1~3所示)，或者含有用于检测hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16-5p 的引物(如 SEQ ID NO:1 ~6 所示)。所述检测膀胱癌血清miRNA内参的试剂盒，还可以包含用于miRNA提取及qRT-PCR 反应所需的RNA分离液、PCR反应液。进一步地，所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，各组分的浓度如下:吐温20:2.5% (体积百分数)，三羟甲基氨基甲烷: 50mmol/L,乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (质量百分数),余量为水。进一步地，所述PCR反应液由IXSyberGreen I荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成，其中，各物质的浓度如下:DNA聚合酶: 100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化镁:6mM ;三羟甲基氨基甲烷盐酸盐:16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，其特征在于：该内参为单独的hsa?miR?193a?5p，或：hsa?miR?193a?5p与hsa?miR?16?5p。
【技术特征摘要】
1.一种用于膀胱癌血清miRNA检测的内参，其特征在于:该内参为单独的 hsa-miR-193a_5p,或:hsa-miR-193a_5p 与 hsa-miR-16_5p02.检测权利要求1所述的用于膀胱癌血清miRNA检测的内参的引物，其特征在于:包括检测 hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，如下:(1)检测hsa-miR-193a-5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如 SEQ ID NO:1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:hsa-miR-193a_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ； hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ； hsa-miR-193a-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)检测hsa-miR-16-5p的引物，包括逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如 SEQ ID NO:4所示，检测引物的序列如SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6所示:hsa-miR-16_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGT...
【专利技术属性】
技术研发人员：王传新，杜鲁涛，刘益民，张欣，杨咏梅，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：
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