单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C～冻存管F各自装有一种单增李斯特菌主要血清型的阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液；本发明专利技术试剂盒仅一步PCR反应便可准确、快速地鉴别单增李斯特菌全部4种主要血清型，该方法价格低廉，操作简便，特异性与灵敏性好，灵敏性可达102CFU/mL，无交叉反应，结果准确可靠并简单易读，适用于大通量的分型操作。

【技术实现步骤摘要】
单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用(-)
本专利技术涉及一种细菌性病原血清型的鉴别诊断，基于多重PCR方法，建立鉴定单增李斯特菌主要血清型的快速分型技术，即单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒及应用方法。(二)
技术介绍
单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是重要的人兽鱼共患食源性病原菌,对环境耐受性强，可在较高的盐浓度(10%NaCl)以及宽泛的pH (pH4.5~9)和温度范围(O~45°C)内生长，并可形成荚膜，因而单增李斯特菌广泛存在于自然界(包括土壤、水源、植物及动物体等)，易污染各种食品(肉、奶、海产品及蔬菜等)。单增李斯特菌可引发胃肠炎、败血症、脑膜炎和流产等，其致死率(20~30%)远高于其他常见食源性病原菌，如肠炎沙门氏菌(约0.38%)、弯曲杆菌(0.02~0.1%)、弧菌(0.005~0.1%)等。2000年即被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一，其危害严重性可见一斑。根据菌体/鞭毛抗原(0/H)的血清学反应，单增李斯特菌可分为13个血清型，SPl/2a、l/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e 与 7 型。其中血清型 l/2a、l/2b、l/2c 与4b为主要血清型，占食品与病人分离株的99%以上；其他血清型则分离率极低。并非所有血清型均表现出相同的致病力。血清型l/2a在食品中分离率最高，但绝大多数暴发或散发的人侵袭型李斯特菌病病例由4b型引起，而胃肠炎型李斯特菌病病例多由l/2a型与l/2b型引起，其他血清型则鲜有引起人发病的案例。侵袭性李斯特菌病与胃肠炎李斯特菌病主要有如下差异:引发胃肠炎的污染食品携带菌量(pathogen load)大，发病急(18~27h),症状包括发热、腹泻、呕吐、 关节痛与头痛等，感染者大多为健康人群；而侵袭性病例主要引发免疫力低下人群的致死性症状。脑膜炎病人的4b型分离率显著高于一般患者，且4b型感染者的死亡率(26%)明显高于其他血清型感染者(16%)，提示4b型可能具有更胜一筹的毒力。因此，亟需建立可鉴别单增李斯特菌各主要血清型的快速分型方法。目前，单增李斯特菌的血清型分型主要为血清学方法，依赖于商品化的菌体与鞭毛抗原，不仅价格昂贵，且存在操作费时、费力、交叉反应多发、试验结果不易判读等弊端，尤其不适用于大通量的分型操作。国内外通过比较基因组学方法，陆续筛选出血清型特异的基因位点，但迄今尚无单增李斯特菌主要血清型的快速分型方法。本专利技术将通过对血清型特异基因的分析、引物与检测条件的优化，设计一种准确、灵敏、简便、快速的多重PCR检测试剂盒，以期填补上述的空白。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种准确、灵敏、简便、快速的单增李斯特菌主要血清型分型试剂盒及使用方法。本专利技术采用的技术方案是:本专利技术提供一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌l/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为高压灭菌双蒸水；所述阳性对照缓冲液为单增李斯特菌EGD-e (血清型l/2a)、单增李斯特菌54004 (血清型l/2b)、单增李斯特菌54002 (血清型l/2c)、单增李斯特菌ATCC19115 (血清型4b)分别接种在BHI培养基中，37°C培养过夜后，取菌液100°C煮沸灭活后离心弃去上清液，取沉淀用双蒸水重悬，制成阳性对照缓冲液样品；所述冻存管A中引物的序列为:Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGTLl-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTG[0011 ] L2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAAL2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGACL3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCCL3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTCL4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA和L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。进一步，所述PCR反应管根据待检测样品数量定，通常试剂盒内所述PCR反应管为100 ~300 个。进一步，优选所述冻存管A内的冻干粉是将混合液先在_80°C超低温冰箱预冻10h，再放入冻干机(干燥箱压力0.03MPa)，温度设为_40°C (升华干燥阶段)持续冻干30h，除去90%以上水分；之后温度升至25°C进行解析干燥2h (升温速率为1.50C /min),使水分含量达到5% (质量浓度)以下，获得冻干粉；所述每8 μ L混合液组成为:Taq DNA聚合酶0.4 μ L，10 X buffer3 μ L, dNTP mixture (含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 IOmM) 0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由终浓度均为IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。进一步，所述冻存管B中裂解液终浓度组成为:体积浓度4%Triton-X100，5mg/mL NaN3, lmol/L Tris，pHS8.0 (用IOM氢氧化钠水溶液调节)，溶剂为蒸馏水，配制方法:Triton-X1004mL, NaN3 (终浓度 5mg/mL) 500mg, Tris (终浓度 lmol/L) 12.114g，用 IOM 氢氧化钠调pH至8.0,蒸懼水定容至100mL。进一步，优选每个试剂盒有100个PCR反应管，所述冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液的体积计为800 μ L (满足100个PCR反应管的用量)，所述冻存管B内装有裂解液ImL,冻存管C~冻存管F各自装有阳性对照缓冲液0.5mL，冻存管G装有1.5mL稀释液(通常冻存管G内的稀释液是一次性加入冻存管A，供100次PCR反应用)，每支冻存管内装样量根据PCR管个数定，冻存管A内冻干粉的量以冻干前混合液体积计，混合液体积与冻存管G内稀释液体积比为8:15，每次PCR反应需要稀释液跟冻干粉混悬制备的混悬液15 μ L、冻存管B内裂解液10 μ L、阳性对照缓冲液5 μ L或待检样品5 μ L。本专利技术还提供一种利用所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒进行单增李斯特菌主要血清型分型的方法，所述分型方法按如下步骤进行:(I)将冻存管G中稀释液加至冻存管A，重悬、混匀制成混悬液，存放于-20°C备用(PCR反应前先在室温下解冻)；所述冻干粉用量以冻干前混合液体积计，所述的冻存管G中稀释液与混合液体积比为15:8 ；(2)将冻存管B中的裂解液分别加入PCR反应管，分为对照PCR反应管和待检PCR反应管，再依次将冻存管C、冻存管D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌1/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌1/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述冻存管A中引物的序列为：L1?F：AGCAAAATGCCAAAACTCGTL1?R：CATCACTAAAGCCTCCCATTGL2?F：AGTGGACAATTGATTGGTGAAL2?R：CATCCATCCCTTACTTTGGACL3?F：AGGGCTTCAAGGACTTACCCL3?R：ACGATTTCTGCTTGCCATTCL4?F：AGGGGTCTTAAATCCTGGAA和L4?R：CGGCTTGTTCGGCATACTTA。

【技术特征摘要】
1.一种单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括冻存管和PCR反应管，所述冻存管包括冻存管A、冻存管B、冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F和冻存管G，所述冻存管A装有用于PCR反应的Taq DNA聚合酶、10 X buffer、dNTP mixture和引物的混合液制备的冻干粉，冻存管B装有裂解液，冻存管C、冻存管D、冻存管E、冻存管F分别装有单增李斯特菌l/2a型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2b型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌l/2c型阳性对照缓冲液、单增李斯特菌4b型阳性对照缓冲液，冻存管G装有稀释液，所述稀释液为双蒸水；所述冻存管A中引物的序列为:Ll-F:AGCAAAATGCCAAAACTCGTLl-R:CATCACTAAAGCCTCCCATTGL2-F:AGTGGACAATTGATTGGTGAAL2-R: CATCCATCCCTTACTTTGGACL3-F:AGGGCTTCAAGGACTTACCCL3-R:ACGATTTCTGCTTGCCATTCL4-F:AGGGGTCTTAAATCCTGGAA和 L4-R:CGGCTTGTTCGGCATACTTA。2.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述PCR反应管为100~300个。3.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于所述冻存管A内的冻干粉是将冻存管A内所述混合液先在_80°C预冻10h，再在_40°C持续冻干30h，然后以1.5°C /min的速率升温至25°C干燥2h使水分含量达到5%以下，获得冻干粉；所述每8 μ L 混合液组成为:Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L，10 Xbuffer3 μ L, dNTP mixture0.6 μ L,浓度均为 50 μ M 的 Ll-F、Ll-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F 和 L4-R 引物各 0.5 μ L，所述 dNTPmixture由终浓度均为IOmM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP构成。4.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于冻存管B中所述裂解液终浓度组成为:体积浓度4%Triton-X100, 5mg/mLNaN3, lmol/L Tris, pH为8.0，溶剂为蒸馏水。5.如权利要求1所述单增李斯特菌主要血清型快速分型试剂盒，其特征在于每个试剂盒有100个PCR反应管，所述冻...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈健舜，
申请(专利权)人：浙江省水产技术推广总站，
类型：发明
国别省市：