一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法技术

本发明专利技术涉及一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法。属于应用生物技术领域。快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，由栉孔扇贝引物、华贵栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物和虾夷扇贝引物组成。鉴定方法包括以下步骤：提取扇贝基因组总DNA，进行多重PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝种类。栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝和华贵栉孔扇贝的PCR产物条带大小分别为514bp、367bp、205bp和149bp。本发明专利技术的鉴定引物及多重PCR方法可以灵敏、快速地确定待检测扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】
—种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法
本专利技术涉及扇贝的鉴别方法，尤其是涉及一种快速鉴定四种扇贝品种的多重PCR引物及方法。
技术介绍
扇贝属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Lamellibranchia)、翼形亚纲(Pterimorphia)、珍珠贝目(Pterioida)、扇贝科(Pectinidae),是我国沿海主要的经济养殖贝类之一。我国沿海主要养殖扇贝种类包括:柿孔扇贝/krreri)、华贵柿孔扇贝(Mimachlamys /7oAi7i5.)、海湾扇贝(Argopecten irrat/iafls)和虫下夷扇贝{Mizuhopectenyessoensis)0柿孔扇贝主要养殖地为我国北部沿海,华贵柿孔扇贝主要养殖地为我国的东部和南部沿海，海湾扇贝为从美国引进品种，虾夷扇贝为从日本和朝鲜引进品种。近年来，随着现代科技对扇贝养殖技术的不断成熟，扇贝养殖规模在山东、辽宁沿海地区不断扩大，扇贝养殖已成为水产养殖的支柱产业。在扇贝遗传育种以及加工贸易过程中，都需准确、快速地鉴定扇贝的种类。传统鉴定扇贝种类的方法主要依靠形态学标准进行，例如:壳色、大小、足丝孔、放射肋、棘等。但是，通常加工后的扇贝只留下闭壳肌，失去了形态学特征，不能利用传统形态学对其进行鉴定。扇贝幼虫还未形成可辨别的形态特征，也不能利用传统形态学对其进行鉴定。因此，在一些情况下传统的方法很难准确鉴定扇贝的种类。所以，亟需一种基于分子生物学技术的能够快速、准确鉴定四种扇贝品种的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝等四种扇贝品种的多重PCR引物及方法，本专利技术的方法可以灵敏、快速地确定待检测养殖扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的:一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成。所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ； 下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’。所述的海湾扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ； 下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3’。所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ； 下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’。 所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为:上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ； 下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。上述的多重PCR引物用于鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝。一种利用上述的多重PCR引物快速鉴定扇贝品种的方法，方法如下: 1)提取待检测扇贝样品的基因组总DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为5-12ng/yL，制备样品 DNA; 2)利用上述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增； 3)PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝的种类:如果出现大小为514bp的条带说明样品为栉孔扇贝；如果出现大小为367bp的条带说明样品为海湾扇贝；如果出现大小为205bp的条带说明样品为虾夷扇贝；如果出现大小为149bp的条带说明样品为华贵栉孔扇贝。上述步骤2)中多重PCR扩增的反应体系为:5yL 10XPCR buffer,4y L浓度为2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的Pl- P8弓丨物各2 μ L，I μ L样品DNA，无菌超纯水补齐到50 μ L0上述步骤2)中多重PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；72°C延伸 7min。本专利技术的有益效果是:本专利技术利用来自扇贝的线粒体基因组COI基因序列设计合成了四对针对四种不同扇贝品种的特异性PCR引物，并利用此引物建立了一个多重PCR反应，实现了利用分子生物学方法快速鉴定四种扇贝品种的新方法。本方法具有操作简单、重复性好、准确、快速、灵敏等优点。本专利技术主要应用于扇贝种质资源保护、遗传育种以及产品鉴定等领域。【附图说明】图1为实施例1鉴定的四种已知扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为柿孔扇贝，泳道2为海湾扇贝，泳道3为奸夷扇贝，泳道4为华贵柿孔扇贝。图2为实施例2快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为柿孔扇贝。图3为实施例3快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker，泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为华贵栉孔扇贝。图4为实施例4快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker，泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为海湾扇贝。图5为实施例5快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为奸夷扇贝。【具体实施方式】下面的实施例是对本专利技术进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1 一种快速鉴定扇贝品种的方法 I)分别取已知品种为栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝的四种扇贝，分别取扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，分别制备样品DNA，即分别得到栉孔扇贝样品DNA、华贵栉孔扇贝样品DNA、海湾扇贝样品DNA和虾夷扇贝样品DNA ； 2)分别对不同品种的样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5μ L IOXPCR buffer,4y L 浓度为 2.5mM 的 dNTP，0.4 μ L 浓度为 5υ/μ1 的 DNA 聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1 μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L;PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存； 3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与1 μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果； 4)PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示:栉孔扇贝样品DNA出现大小为514bp的条带；海湾扇贝样品DNA出现大小为367bp的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，其特征在于多重PCR引物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成；所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为：上游引物?P1：5’?–?ATACCCTCCGCTGTCGTCTA?–3’?；下游引物?P2：5’?–?CGCGTCTAATCCCACCGTAA?–3’?；所述的海湾扇贝引物的DNA序列为：上游引物?P3：5’?–?TGTTCTGATCTTGCCTGGGT?–3’?；下游引物?P4：5’?–?AGCCACATCAAGACACGCAT?–3’；所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为：上游引物?P5：5’?–?TGTTGATCTTGGACCGGCAT?–3’?；下游引物?P6：5’?–?GCATACATCATTGCCACCGC?–3’?；所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为：上游引物?P7：5’?–?CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT?–3’?；下游引物?P8：5’?–TCAGCCTTATACGCCTTGCC?–3’?。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，其特征在于多重PCR弓丨物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成； 所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ； 下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’ ； 所述的海湾扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ； 下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3，； 所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ； 下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’ ； 所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ； 下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。2.权利要求1所述的多重PCR引物在鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝中的应用。3.一种利用权利要求1所述的多重PCR引物快速鉴定...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏生，艾海新，张力，赵健，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：