一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法技术

本发明专利技术属于生物工程检测技术领域，具体为一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法。本发明专利技术包括如下步骤：结核分枝杆菌特异性定量PCR和RT-qPCR引物和探针设计；标准DNA的克隆和质粒改造；细菌RNA与DNA的同时抽提；在同一反应管中同时进行RT-qPCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。利用本发明专利技术的方法可以实现对结核分支杆菌的快速定量检测，并确定细菌的生长活性状态。本发明专利技术方法简单、灵敏度高、特异性强，解决了现有检测方法中检测周期长、阳性率低、不能区分细菌的生长状态的问题，对基础研究、临床快速诊断，及药物开发和药物使用效果的临床评价具有重要的实际意义。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法
本专利技术属于生物工程检测
，具体涉及临床标本中结核分枝杆菌的荧光定量检测方法。
技术介绍
结核病(TB)是一种危害严重的慢性传染病，全球有约20亿人被感染，每年新增结核病患者达800-1000万，每年因结核病死亡人数为200-300万。我国结核病情况同样较为严峻，年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。20世纪90年代以来，结核病群或高危人群的流动或移民以及结核病控制放松及艾滋病病毒（HIV）与结核分枝杆菌双重感染蔓延等因素使结核病在全球的传播有“死灰复燃”的趋势。同时，耐药、耐多药（MDR）及超耐药（XDR）结核病占结核病比率提高，导致多种一、二线抗结核药物治疗效果下降，诊断及治疗成本上升，许多国家不同程度地出现了疫情下降缓慢或严重反弹的局面，发病率以每年1.1％的速度增长，结核病再次成为威胁人类健康的主要传染病，带来严重的公共卫生问题和重大的经济社会问题。据世界卫生组织报道,目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌,即20亿人口感染了结核杆菌,其中活动性肺结核病人约2000万,每年新增结核病人约800～1000万,每年约有300万人死于结核病。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。结核病在我国流行的特点为“四高一低”：高患病率、高耐药率、高死亡率、高感染率和低递降率。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万。因此结核病防治是我国乃至全球疾病防治的重要课题。近年来世界各地结核分枝杆菌的多耐药菌株逐渐增多，甚至引起暴发流行。结核分枝杆菌的耐药可由自发突变产生（原发性耐药）或由于用药不当经突变选择产生（继发性耐药）。目前滥用抗生素、过渡治疗的现象很普遍，如何准确快速判断药物治疗的药效是目前急需解决的问题。临床诊断肺结核的主要依据是检测痰中结核分枝杆菌，其中，涂片法简单易行，但阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准，但检测周期长，均难以满足临床需要。因此提供敏感、特异、快速、可靠、简便、适合临床应用的实验室检查技术已成为国内外研究的重点。其中实时荧光PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针（TaqMan探针），目前常用的TaqMan探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如TAMRA等。对于完整的TaqMan探针，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号随着目的片段的扩增而指数增长，检测每个循环结束后的荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及未知模板的扩增曲线可对未知模板进行定量分析。目前已有的检测方法是单独检测样本DNA或者RNA,但还没有在同一管反应中同步检测RNA和DNA的报道。在前期工作基础上，本专利技术提出在同一管反应中同时检测RNA和DNA的方法，具体为：分别以结核分枝杆菌复合群的16SrRNA基因和23SrRNA基因为靶目标，对16SrRNA设计一条逆转录引物、一对PCR引物以及一条Taqman探针，对23SrDNA设计另一对PCR引物以及另一条Taqman探针，在一个反应体系中同时进行RT-qPCR（16srRNA+16srDNA）和qPCR（23SrDNA）。分别测定总核酸（DNA+RNA）、以及DNA的绝对浓度，并算出(DNA+RNA)/DNA比值。具体地，通过分别比较16SrRNA和23SrDNA的Ct值以及5个绝对浓度已知的定量内参做出的标准曲线，可以求得待测标本中结核分枝杆菌(RNA+DNA)和DNA的绝对浓度，作为待测标本中结核分枝杆菌核酸定量检测结果,判断结核分枝杆菌的有无及丰度；通过比较16SrRNA总核酸与23SrDNA的Ct值(分别对应FAM和HEX检测通道)，可以算出(DNA+RNA)/DNA比值，作为判定标本中细菌生长活性的标准：当该比值大于200时，待测标本中结核分枝杆菌为活跃生长的活菌，当比值在2-200之间，为生长较慢的活菌，比值小于2时，为不生长的死菌。此方法的优势：（1）可以比较结核分枝杆菌中RNA和DNA的相对量，从而判断细菌的生长状态；（2）样本需求量变少，加上（DNA+RNA）的量一般比DNA量大数十倍甚至更多，可以提高检测灵敏度；（3）方法更简便，两管PCR反应，合并到一管，节约成本和工作量；（4）由于在同一管中进行PCR，反应效率一致，DNA与RNA的比值更加精确。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中存在的缺陷，提供一种检测灵敏度高、且操作简单的结核分枝杆菌DNA与RNA同步检测的荧光定量PCR分析方法。本专利技术提供的结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测方法，通过对RDP(RibosomalDatabaseProject)中结核分枝杆菌复合群的16SrRNA和23SrDNA全序列进行生物信息学比对分析,选取序列保守片段为靶目标，应用primerexpress软件和primerpremier5.0软件，设计一条逆转录引物和两对PCR引物以及两条Taqman探针。本专利技术方法所用的结核分枝杆菌复合群特异性定量检测试剂包含一条逆转录引物和两对特异性PCR引物以及两条特异性荧光探针，扩增目的扩增片段长度分别为100bp（16SrRNA基因）和67bp（23SrDNA）。具体来说，本专利技术提供的结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，具体步骤如下：1、通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16SrRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：GGGATGCATGTCTTGTGGTGGAAAGCGCTTTAGCGGTGTGGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGACGGCCTACCAAGGCGACGACGG（SEQIDNO.5）选择结核分支杆菌的23SrRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：TGGGTCCTGAGGCAACACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGT（SEQIDNO.9）2、应用primerexpress软件和primerpremier5.0软件，设计一条结核分支杆菌的逆转录引物和两对PCR引物以及两条Taqman探针，具体地：16SrRNA引物和探针序列为：逆转录引物MTBC-RT：5’-CCGTATCTCAGTCCCAGTGT-3’(SEQIDNO.1)上游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16S?rRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ?ID?NO.5；选择结核分支杆菌的23S?rRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ?ID?NO.9；（2）应用primer?express软件和primer?premier?5.0软件，设计关于16S?rRNA和23S?rRNA的引物和探针序列，具体为：16S?rRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQ?ID?NO.1；?上游引物：?SEQ?ID?NO.2；下游引物：?SEQ?ID?NO.3；Taqman探针序列：?SEQ?ID?NO.4；?23S?rRNA引物和探针序列：上游引物：?SEQ?ID?NO.6；下游引物：?SEQ?ID?NO.7；Taqman探针序列：?SEQ?ID?NO.8；（3）构建和制备质粒定量标准品?利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因克隆到质粒载体pGEM?T?Easy?Vector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌RNA/DNA同步定量分析的定量标准品；（4）分离样本中结核分枝杆菌，提取总核酸，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；（5）分别以结核分枝杆菌复合群的16S?rRNA和23S?rDNA为靶目标，对16S?rRNA，使用设计的一条逆转录引物、一对PCR引物以及一条Taqman探针；对23S?rDNA，使用设计的另一对PCR引物以及另一条Taqman探针，对提取的同一例样本同时进行RT?qPCR，其中，RT部分为单重的只针对16S?rRNA的逆转录反应,?qPCR部分为两重的针对16S?rRNA和23S?rRNA的实时定量PCR反应；通过比较16S?rRNA?和23S?rDNA的Ct值以及5个绝对浓度已知的定量内参做出的标准曲线，求得待测标本中结核分枝杆菌DNA的绝对浓度，作为待测标本中结核分枝杆菌DNA定量检测结果；计算分别对应FAM和HEX检测通道的16S?rRNA与23S?rDNA的Ct值，算出(DNA+RNA)/DNA比值，作为判定标本中结核分枝杆菌生长活性的标准：当该比值大于200时，待测标本中结核分枝杆菌为活跃生长的活菌，当比值在2?200之间，为生长较慢的活菌，比值小于2时，为不生长的死菌。...

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16SrRNA的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.5；选择结核分支杆菌的23SrDNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.9；（2）应用primerexpress软件和primerpremier5.0软件，设计关于16SrRNA和23SrDNA的引物和探针序列，具体为：16SrRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQIDNO.1；上游引物：SEQIDNO.2；下游引物：SEQIDNO.3；Taqman探针序列：SEQIDNO.4；23SrDNA引物和探针序列：上游引物：SEQIDNO.6；下游引物：SEQIDNO.7；Taqman探针序列：SEQIDNO.8；（3）构建和制备质粒定量标准品利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因SEQIDNO.5和SEQIDNO.9克隆到质粒载体pGEM-TEasyVector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌RNA/DNA同步定量分析的定量标准品；（4）分离样本中结核分枝杆菌，提取总核酸，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；（5）分别以结核分枝杆菌复合群的16SrRNA和23...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑶，彭劲甫，骆子义，吴海，姜丽娟，
申请(专利权)人：复旦大学，深圳市浩鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：