一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法技术

本发明专利技术属于生物工程检测技术领域，具体为一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法。本发明专利技术包括如下步骤：结核分枝杆菌特异性定量PCR和RT-qPCR引物和探针设计；标准DNA的克隆和质粒改造；细菌RNA与DNA的同时抽提；在同一反应管中同时进行RT-qPCR和PCR；荧光定量PCR检测方法的建立和优化。利用本发明专利技术的方法可以实现对结核分支杆菌的快速定量检测，并确定细菌的生长活性状态。本发明专利技术方法简单、灵敏度高、特异性强，解决了现有检测方法中检测周期长、阳性率低、不能区分细菌的生长状态的问题，对基础研究、临床快速诊断，及药物开发和药物使用效果的临床评价具有重要的实际意义。

【技术实现步骤摘要】
一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法
本专利技术属于生物工程检测
，具体涉及临床标本中结核分枝杆菌的荧光定量检测方法。
技术介绍
结核病(TB)是一种危害严重的慢性传染病，全球有约20亿人被感染，每年新增结核病患者达800-1000万，每年因结核病死亡人数为200-300万。我国结核病情况同样较为严峻，年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。我国结核病患病人数居世界第二位，仅次于印度。20世纪90年代以来，结核病群或高危人群的流动或移民以及结核病控制放松及艾滋病病毒（HIV）与结核分枝杆菌双重感染蔓延等因素使结核病在全球的传播有“死灰复燃”的趋势。同时，耐药、耐多药（MDR）及超耐药（XDR）结核病占结核病比率提高，导致多种一、二线抗结核药物治疗效果下降，诊断及治疗成本上升，许多国家不同程度地出现了疫情下降缓慢或严重反弹的局面，发病率以每年1.1％的速度增长，结核病再次成为威胁人类健康的主要传染病，带来严重的公共卫生问题和重大的经济社本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16S?rRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ?ID?NO.5；选择结核分支杆菌的23S?rRNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQ?ID?NO.9；（2）应用primer?express软件和primer?premier?5.0软件，设计关于16S?rRNA和23S?rRNA的引物和探针序列，具体为：16S?rRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQ?ID?NO.1；?上游引物：?SEQ?ID?NO.2；下游引物：...

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的结核分枝杆菌RNA/DNA同步定量分析方法，其特征在于具体步骤如下：（1）通过生物信息学分析，选择结核分支杆菌的16SrRNA的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.5；选择结核分支杆菌的23SrDNA基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列为：SEQIDNO.9；（2）应用primerexpress软件和primerpremier5.0软件，设计关于16SrRNA和23SrDNA的引物和探针序列，具体为：16SrRNA引物和探针序列：逆转录引物：SEQIDNO.1；上游引物：SEQIDNO.2；下游引物：SEQIDNO.3；Taqman探针序列：SEQIDNO.4；23SrDNA引物和探针序列：上游引物：SEQIDNO.6；下游引物：SEQIDNO.7；Taqman探针序列：SEQIDNO.8；（3）构建和制备质粒定量标准品利用DNA重组技术将包含目的扩增片段的基因SEQIDNO.5和SEQIDNO.9克隆到质粒载体pGEM-TEasyVector中，构建的重组质粒作为检测结核杆菌RNA/DNA同步定量分析的定量标准品；（4）分离样本中结核分枝杆菌，提取总核酸，使提取的样本中同时含有DNA与RNA成分；（5）分别以结核分枝杆菌复合群的16SrRNA和23...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑶，彭劲甫，骆子义，吴海，姜丽娟，
申请(专利权)人：复旦大学，深圳市浩鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：