本发明专利技术公开了一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域，属于细胞生物学领域。本发明专利技术首次确定了PtpA的泛素蛋白结合结构域及其关键结合位点（A140），所述泛素结合结构域是从PtpA蛋白的第115位氨基酸到第161位氨基酸，其中，疏水氨基酸序列EEVFAVIESA（136-145）能够与泛素发生疏水相互作用。当UIML结构域的A140位点发生突变可导致Ub与PtpA结合能力及其酶活调控功能的丧失。本发明专利技术成果为基于PtpA分子的抗结核药物筛选和疫苗开发提供了特异性序列，为临床多种疾病的治疗提供新的工具和思路，尤其在抗肿瘤等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可以直接应用于科研领域或指导开发可逆性调控JNK和P38信号通路的制剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域，属于细胞生物学领 域。
技术介绍
结核病（Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)引 起的古老疾病，它与艾滋病、疟疾并称为当今世界威胁人类健康的三大传染病。研究表明 结核分枝杆菌基因组共编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine protein kinase，STPK)和两种真核样酪氨酸磷酸酶（PtpA和PtpB)，它们在结核分枝杆菌感染宿主 巨噬细胞的过程中可被分泌至宿主细胞的胞质中，这些蛋白分别与宿主细胞中不同的蛋白 分子相互作用，并且通过调控宿主细胞中各个靶蛋白的磷酸化水平来达到干扰真核生物信 号通路的目的。这些病原菌-宿主互作蛋白及其相关的炎症和免疫信号通路将可能为抗结 核新药设计提供全新的理想靶点。 结核分枝杆菌在宿主细胞内分泌的PtpA蛋白属于低分子量酪氨酸磷酸酯酶家 族，也叫做LowMWPTPs。研究表明：PtpA蛋白与真核细胞中的酪氨酸磷酸酯酶有很强的相似 性，它在病原宿主互作过程中起着重要的作用，参与调控多种重要的生理病理过程，并且已 发现PtpA蛋白与宿主中两个蛋白分子(包括自噬相关蛋白VPS33B和V-ATPase复合体的H 亚基)存在相互作用，从而干扰宿主细胞的自噬过程以及对结核分枝杆菌的清除作用。但目 ill有关PtpA蛋白对细胞信号通路等方面的影响尚未明确。 促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK) 级联反应通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能 活动中发挥关键作用。JNK和P38信号转导通路是MPK通路的两个重要分支，它们在细胞 增殖、细胞分化、细胞凋亡和细胞应激等多种生理和病理过程中起重要作用，而JNK和P38 蛋白激酶分别是两个信号通路的中的关键调控因子。当外界有细胞因子（TNFa，IL-1)、生 长因子（EGF)、特定抗原，以及紫外线和放射线等存在时，JNK和P38蛋白就会接受上游信 号分别被磷酸化活化成P-JNK和P-P38,并且进一步磷酸化激活下游蛋白，进而激活信号通 路，调控目的基因的转录水平。我们之前的研究确定了可以抑制JNK和P38两条信号通路 的结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA，并发现泛素分子可以显著提高PtpA的酶活性。 本专利技术旨在进一步揭示泛素调控PtpA的磷酸酶活性的分子机制及其调控序列及 关键的调控位点，进而特异地调控PtpA酶活性及结核分枝杆菌的胞内存活。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域 (Ubiquitin-interacting motif-like, UIML 结构域)，其氨基酸序列如（a)或（b)或（c): (a) SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列； (b )在（a )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有 泛素结合结构域功能的由（a)衍生的多肽或其类似物； (C)与（a)、（b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a)衍生的多肽或其类 似物。 所述结核分枝杆菌分泌蛋白是PtpA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所 述结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA可抑制JNK和P38两条信号通路，泛素与PtpA通过WML结 构域直接结合后显著提高PtpA的磷酸酯酶活性。 所述泛素结合结构域是一种新的类似于真核细胞蛋白的UIM结构域的类ΠΜ泛素 结合结构域，是从PtpA蛋白的第115位氨基酸到第161位氨基酸，其中，疏水氨基酸序列 EEVFAVIESA (136-145)能够与泛素发生疏水相互作用。 所述WML结构域的A26位点（即PtpA分子的A140位点）是可改变结核分枝杆菌 分泌蛋白与泛素分子结合能力的关键位点，该特异位点的突变（A140E)可导致Ub与PtpA结 合能力及其酶活调控功能的丧失。 所述WML结构域及其关键位点可用于制备抗结核药物和新型疫苗，还可用于制 备调控JNK和P38的磷酸化水平的药物。 本专利技术要解决的第二个技术问题是提供所述WML结构域蛋白的制备方法，是将 HML结构域基因连接到载体pGEX-6P-l，得到重组质粒pGEX-6P-1-PtpA-UML ;将重组质粒 转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG在30°C条件下诱导蛋白表达；超声破菌、高速离心后收取 上清液；将上清液缓缓流过填充好的Glutathione-Sepharose beads中，然后加入柱洗漆缓 冲液充分洗涤柱子，最后加入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；将收集的洗脱液加入到IOKD的蛋白 浓缩管中，3500rpm离心浓缩20分钟；再在蛋白浓缩管中加入2mlPBS混匀后离心，分装蛋 白，-80°C保存待用。 本专利技术成果揭标了宿主泛素分子被结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA分子所利用而提 高后者酶活的分子机制及其特异性结合序列及关键位点。本专利技术为基于PtpA分子的抗结 核药物筛选和疫苗开发提供了特异性靶序列，基于该特性靶序列的抗结核新药和新型疫苗 将有望提高抗结核治疗的有效性和特异性并进而降低抗结核药物的毒副作用。此外，由于 临床上多种疾病的发生都与JNK和P38信号通路的活性相关，调控JNK和P38的磷酸化水 平对于很多疾病都有控制作用。因此本专利技术成果将来还可为临床多种疾病的治疗提供新的 工具和思路，尤其在抗肿瘤等多种药物的开发和临床应用等方面将有着广阔的前景，也可 以直接应用于科研领域或指导开发可逆性调控JNK和P38信号通路的制剂。【附图说明】 图I =PtpA蛋白序列及晶体结构的解析。 图2 :结核分枝杆菌分泌蛋白PtpAUML与宿主的Ub分子直接相互作用。 图3 :PtpA的A140E突变对泛素对PtpA磷酸酯酶活性调控能力的影响。 图4 :PtpA的A140E突变导致泛素丧失对其介导的去磷酸化p-JNK和p-P38的活 性调控功能。【具体实施方式】 结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA的制备方法、泛素蛋白的制备方法，以及泛素对 PtpA去磷酸化p-JNK和p-P38蛋白的影响、体外实验反应体系等参见中国专利技术专利申请 201310466907. 2 (-种使p-JNK和p-P38去磷酸化的结核分枝杆菌分泌蛋白PtpA)。当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种结核分枝杆菌分泌蛋白的泛素结合结构域，其特征在于，氨基酸序列如（a）或（b）或（c）：（a）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有泛素结合结构域功能的由（a）衍生的多肽或其类似物；（c）与（a）、（b）中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由（a）衍生的多肽或其类似物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘翠华，汪静，李冰曦，鲁燕，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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