本发明专利技术公开了水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在水稻抗光抑制中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术通过T-DNA插入突变体的方法，研究了水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2功能丧失后突变体的表型，验证了该基因在水稻中的生理功能，证明了在水稻中紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2能控制NPQ、qP、叶绿素含量等表型，对水稻的光保护发挥了重要作用。
【技术实现步骤摘要】
水稻紫黄素脱环氧化酶基因0sVDE2在提高水稻抗光抑制 能力中的应用
本专利技术属于植物基因工程
，涉及水稻紫黄素脱环氧化酶(Violaxanthinde-epoxidase, VDE)基因0sVDE2的应用，具体涉及水稻紫黄素脱环氧化酶基因0sVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用。
技术介绍
光是植物光合作用所必需的，然而，当植物吸收的光能超过其所需时，过剩的光能会导致光抑制现象，从而明显降低光合效率。研究表明，当照射在叶片的光量子流量密度达到最大阳光辐射强度的1/4时，叶片光合速率A即已趋于饱和。不能用于光化学反应，也不能以荧光及热的形式耗散，激发能将转移到氧分子，产生对光合机构具高度破坏性的活性氧自由基。热耗散是以反馈去激发机制介导进行的，可以通过测量叶绿素荧光非光化淬灭(Non-photochemical quenching, NPQ)参数来衡量。非光化淬灭调节着光系统II的能量转换，保护植物免受或减轻光抑制。非光化淬灭由高光强诱导产生，随着关闭高光强而弛豫。根据其弛豫动力学特性，非光化淬灭可以分为至少3个组分:依赖能量的淬灭qE、状态转换淬灭qT及光抑制淬灭ql，其中qE是高等植物中的最主要组分。对模式植物拟南芥的研究表明，类囊体跨膜PH梯度、叶黄素循环中合成积累的玉米黄素、光系统II PsbS蛋白及其表达量是控制非光化淬灭产生以及决定qE及整个NPQ容量大小的重要因子。现阶段认为qE的作用模式如下:当光合作用中光反应产生的化学能超过了同化反应如CO2固定的能力时，叶绿体类囊体腔内酸性逐渐增强。PH值不断下降激活了紫黄素脱环氧化酶，在强光下该酶促进紫黄素转变为玉米黄素。玉米黄素具双重功能，它一方面参与了非光化淬灭的形成，另外还具有直接的抗氧化剂功能。叶绿体类囊体腔PH值下降还促进了光系统II PsbS蛋白的质子化，接着导致与叶绿素及类胡萝卜素结合的捕光蛋白复合体构象的改变。过剩激发能的耗散是通过类胡萝卜素自由基阳离子电荷传递机制以及叶绿素与类胡萝卜素之间的能量传递进行的。水稻通常在高自然光强条件下生长，晴朗的中午光合光量子流量密度(PPFD) —般在2，000μηιο1 m 2S 1以上,其光合作用在远低于最大光强时就已经饱和。qE在水稻大部分叶片中均会被强烈诱导，以安全耗散过剩激发能、避免或减轻光抑制，这对于水稻可持续健康生长非常重要。目前在水稻中仅克隆了控制qE值的基因OsPsbSl，该基因表达量与植株NPQ值呈显著正相关。本专利技术证明了在水稻中紫黄素脱环氧化酶0sVDE2基因控制NPQ、叶绿素含量等表型，对水稻的光保护发挥了重要作用。
技术实现思路
本专利技术通过T-DNA插入突变体的方法，研究了水稻紫黄素脱环氧化酶基因0sVDE2功能丧失后突变体的表型，验证了该基因在水稻中的生理功能。该基因在NCBI注释号为NP_001052592,蛋白注释为 hypothetical protein, CDS 注释为 Similar to Violaxanthinde-epoxidase precursor。具体来说，本专利技术利用水稻功能基因组研究的一种有效途径，即T-DNA插入导致基因突变，不能正常转录及表达相应的蛋白，突变体表现为NPQ值显著下降、植株叶片黄化等现象。【附图说明】图1是利用双引物法鉴定0sVDE2基因部分突变体的基因型。图2是0sVDE2基因在各家系突变体植株中的表达量分析。图3是生长期突变体植株M2-2与野生型Dongjin的照片。图4是生长期突变体植株M2-2与野生型Dongjin的叶片照片。【具体实施方式】1.突变体基因型分析抽提突变体植株的小样DNA，实施方法如下:取约2cm长的水稻叶片置于1.5ml (或2ml)离心管中；在研钵中加入800 μ I1.5XCTAB,研磨叶片至匀衆并倒回离心管内；65°C水浴20_30min,每5min中颠倒混匀一次;加入800 μ I氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀，持续IOmin ; 1000Orpm离心，IOmin ；吸取400 μ I上清液至新的 离心管，加入2倍体积经冰镇的95%乙醇，-20°C冰镇20min ；12000rpm离心，15min ;弃上清,加入500 μ I 75%乙醇，12000rpm离心5min ;弃上清,置于超净台吹干或自然晾干，加100 μ I ddH20溶解。对每一株突变体进行鉴定，采用双引物法扩增目标片段。PCR扩增所用到的三条引物分别为:LP:ACATATGGAAAAATCGGGGGRP:AACAATGGCATGTGGTGTTG2715-LB:CTCTAGAGTCGAGAATTCAGTACA其中扩增基因组条带所用到的引物组合为LP+RP，可以扩增出大约IKb左右的条带；扩增载体带所用到的引物组合为RP+LB，可以扩增出大约500bp左右的条带。PCR标准程序参见J.萨姆布鲁克等，2002,分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社介绍的方法。PCR 采用 20 μ I 的反应体系，包含:20-50ng DNA 模板，IOmM Tris-HCl, 50mMKCl, 0.l%Triton X-100, 1.8mM MgCl2, 0.1mM dNTP, 0.2 μ M引物和 IU Taq DNA polymerase?PCR 扩增的条件为:94°C预变性 4min ;94°C lmin，58°C 30s, 72°C lmin，34 个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳,25min后在凝胶成像分析仪上分析条带的大小。利用双引物法鉴定0sVDE2基因部分突变体的基因型，结果见图1，从图中可以看出，M2-2和M2-10为纯合阳性植株，M2-3、M2-5、M2-7、M2-8、M2-9为杂合基因型植株，M2-4和M2-6为纯合阴性植株，即野生型植株。2.表达量分析对突变体植株进行0sVDE2基因的表达量检测，首先要抽提突变体材料抽穗期剑叶中总RNA，再将RNA反转录成cDNA，最后进行表达量检测。所用到的仪器为ABI公司生产的7500实时荧光定量PCR仪，所采用的方法如下:准备cDNA，并用内参基因Ubiquitin对cDNA进行常规RT-PCR扩增，确保cDNA浓度和质量基本一致；用到的引物为:RT-Fl:AACTTTGTACAACTGTTCCART-Rl:ATTGCCATAAAGTACCGAAG。反应体系，cDNA 2 μ I和ddH20 4 μ I组成一个mixl进行分装，RT-Fl和RT-Rl各0.5 μ 1，ddH205 μ I 组成 mix2 进行分装；SYBR Green I (2X )和 ROXReference Dye II 组成mix3进行分装。运行程序，预变性95°C 10s，扩增反应95°C 5s，60°C 34s，40~45cycles，溶解曲线(第一次做检测必须做溶解曲线，要求溶解曲线为单峰)95°C 15s，60°C lmin，95°C 15s，60°C 15s。最后生成文件，以CT值进行表达量的计算。0sVDE2基因在各家系突变体植株中的表达量分析结果见图2，从图中可以看出，纯合阳性植株，如M2-2、M2-10、本文档来自技高网...
【技术保护点】
水稻紫黄素脱环氧化酶基因OsVDE2在提高水稻抗光抑制能力中的应用。
【技术特征摘要】
1.水稻紫黄素脱环氧化酶基因0SVD...
【专利技术属性】
技术研发人员：王功伟，李星磊，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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