本发明专利技术涉及一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒。本发明专利技术所述的LAMP引物包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及2对环引物（LF1和LB1，或者LF2和LB2）；所述试剂盒包括所述LAMP引物、Bst?DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液等。本发明专利技术利用环介导等温扩增反应（LAMP），由Bst?ploymerase和所述LAMP引物对靶基因BCSP31进行特异性扩增，可以快速、准确、方便地检测出人血样或者牛奶中的布鲁氏菌。本发明专利技术所述的检测方法灵敏度较高，检测下限可达到35fg，反应时间短，不需要昂贵的仪器来实现，可操作性强；并且产物检测方便，通过肉眼观察或染色法就能实现，具有很高的实用价值。
【技术实现步骤摘要】
—种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒
本专利技术涉及一种快速检测布鲁氏菌的方法以及LAMP引物及包含该引物的试剂盒，属于微生物检测
。
技术介绍
布鲁氏菌(Brucella spp.)是一种革兰氏阴性菌，无鞭毛，无芽孢，光滑有荚膜。常在细胞内寄生。内毒素是其重要的致病物质。布鲁氏菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主，具有较强的侵袭力。根据表型，抗原性及宿主的不同，布鲁氏菌被分为6各种，分别是Brucella abortus (牛种布鲁氏菌)，Brucella melitensis (羊种布鲁氏菌)，Brucellaovis (绵羊附睾种布鲁氏菌)，Brucella canis (犬种布鲁氏菌)，Brucella suis (猪种布鲁氏菌)and Brucella neotomae (沙林鼠种布鲁氏菌)；感染人类的主要是牛种布鲁氏菌,羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌。长久以来，布鲁氏菌一直被列为潜在的生物武器。布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染病，在许多国家引起了严重的公共健康问题和农业经济问题。该病可以导致许多家畜和野生动物流产和不育；人类感染布鲁氏菌的临床症状表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍症状、关节炎等非特异性症状。由于布鲁氏菌病的临床症状是非特异性的，并且变化无常，因此必须借助实验室诊断技术对布鲁氏菌病进行最后的确诊。细菌学检测是必要的，但是细菌在培养基中生长较慢，并对实验室工作人员有危险；血清学诊断虽然比较简单，但是特异性比较低，因为布鲁氏菌的脂多糖与其他病原菌的脂多糖(如小肠结肠炎耶氏菌)存在结构相似性，因此容易产生交叉反应；基于DNA的PCR检测方法敏感，准确，快速，可以替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测`费用及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。因此，迫切需要开发出一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌病的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中无法快速、准确的检测布鲁氏菌的不足，提供一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌的方法；进一步的，本专利技术提供了一种能够快速检测布鲁氏菌的LAMP引物以及包含该引物的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的:一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向外引物B3。所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的环引物LFl和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的环引物LF2和LB2。一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，包括:权利要求1或2所述的LAMP引物、BstDNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水；其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mM pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2S04U6mM MgS04、0.2% 吐温 20,1.6M 甜菜碱以及 2.8mM dNTPs所述试剂盒包括40?]\1/^1^引物卩1?10(^1^，40?]\1/^1^引物81?10(^1^，5?]\1/^1^弓丨物 F3100y L，5pM/y L 引物 B3100 μ L，20ρΜ/μ L 引物 LFl 或 LF2100 μ L，20pM/μ L 引物 LBl或LB2100 μ L，8U/ μ L的Bst DNA聚合酶100 μ L，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL,去离子水ImL0一种利用权利要求3所述的试剂盒检测布鲁氏菌的方法，包括如下步骤:S01:制备模板 DNA;S02:以SOl中所得的DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的LAMP引物，于60°C~65°C进行LAMP扩增反应，反应时间为55min~90min ;所述LAMP扩增反应的体系为25 μ L，各组分的含量如下:模板 DNA2μΙ_40ρΜ/μΙ_ 引物 FIPΙμΙ40ρΜ/μ!_ 引物 BIP1μ!_5ρΜ/μ1_#_Ρ31μ!_5ρΜ/μΙ_ 引物 Β3ΙμΙ含dNTPs的反应缓冲液12 5μ?Bst DNA 聚合酶1μ!_去离子水5.5μΙ_ 或者模板DNA2μΙ40ρΜ/μ!_ 引物 FIP1μ1_40ρΜ/μ? 引物 BIP1μ1_5ρΜ/μΙ_ 引物I F31μ1_5ρΜ/μ1_ 引物 Β31μ!_5ρΜ/μΙ_ 引物 LFl 或 LF2Ιμ?5ρΜ/μΙ_ 引物 LBl 成 LB21μ1_含dNTPs的反应缓冲液12.5μ!_Bst DNA 聚合酶1μΙ_ 去离子水3.5μ?S03:扩增结果判定。所述步骤S02中，利用Real-time turbidimeter池度仪进行LAMP扩增反应；通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存 在。[0021 ] 本领域技术人员也可以根据实际需要按比例调节所述步骤S02中的反应体系，亦可以实现本专利技术。所述步骤S02中，所述LAMP扩增反应的温度为63°C，时间为90min。在所述步骤S02结束后，可以将反应产物于80°C恒温灭活5min或95°C恒温灭活5min。所述布鲁氏菌为人体血液或者牛奶中的布鲁氏菌。一种利用所述的试剂盒进行检测布鲁氏菌的应用。BCSP31基因在所有布鲁氏菌种和生物型中是保守的，它编码了大小为31 ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白质。该基因于1988年被克隆测序和体外表达；1992年Baily等扩增BCSP31基因的一段大小为223bp的片段，结果表明该序列在牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌中是保守的；1996年Da Costa等证实BCSP31基因能鉴别所有的布鲁氏菌种和生物型，他们还检测了其他98种对照细菌，结果均为阴性；王胜昌等(2003)以BCSP31为靶基因建立套式PCR反应，不同型的布鲁氏菌都能出现预期的扩增带；结果表明BCSP31序列具有高度的布鲁氏菌特异性，可用于鉴别布鲁氏菌。环介导等温扩增技术(LAMP,loop-mediated isotherma lamplification)是一种全新的核酸扩增方法。该法在等温条件下(60~65°C )就能完成扩增反应，它可以在Ih以内在恒温条件下特异地扩增DNA到109个拷贝，在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间。LAMP技术利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。由于它针对靶基因的6个区域设计4种特意的引物，因而对靶基因序列有高度的特异性；如果再增加一对环引物，则可以使反应加速，提高扩增效率。LAMP扩增结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示的反向外引物B3。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向外引物B3。2.根据权利要求1所述的用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的环引物LFl和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的环引物LF2和LB2。3.一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，包括:权利要求1或2所述的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水； 其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mM pH8.8的Tris_HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2S04U6mM MgS04、0.2% 吐温 20,1.6M 甜菜碱以及 2.8mM dNTPs。4.根据权利要求3所述的用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括40ρΜ/μ L 弓丨物 FIPlOOy L,40pM/y L 弓丨物 BIP100 μ L, 5ρΜ/μ L 弓丨物 F3100 μ L, 5ρΜ/μ L 引物 Β3100 μ L, 20ρΜ/ μ L 引物 LFl 或 LF2100 μ L, 20ρΜ/ μ L 引物 LBl 或 LB2100 μ L, 8U/ μ L 的Bst DNA聚合酶100 μ L，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL，去离子水lmL。5.一种检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤:...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀江，蒋丹，杨志达，靳卫林，闫强，
申请(专利权)人：黄耀江，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。