本发明专利技术公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应用。本发明专利技术以羊布鲁氏菌M5基因组为模板，PCR得到znuA基因的上、下游同源臂，并将其连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5-Δbp26细胞中，分别通过氯霉素和蔗糖选择培养基筛选，得到同源重组双交换子，为重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA。该菌株较M5亲本菌株，生长特性一致，遗传稳定使其不易返祖，毒力小且免疫效果保持良好，并因bp26基因缺失标记可应用于区分检测自然感染或人工免疫。因此，该菌株可作为一种效果更佳的标记疫苗应用于临床。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应用。本专利技术以羊布鲁氏菌M5基因组为模板，PCR得到znuA基因的上、下游同源臂，并将其连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5-Δbp26细胞中，分别通过氯霉素和蔗糖选择培养基筛选，得到同源重组双交换子，为重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA。该菌株较M5亲本菌株，生长特性一致，遗传稳定使其不易返祖，毒力小且免疫效果保持良好，并因bp26基因缺失标记可应用于区分检测自然感染或人工免疫。因此，该菌株可作为一种效果更佳的标记疫苗应用于临床。【专利说明】羊布鲁氏菌重组菌株M5- A bp26- A znuA及制备方法与应用
本专利技术属于重组细菌疫苗领域，特别涉及一株羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)重组菌株M5- A bp26- A znuA及制备方法与应用。该菌株是在羊型5号弱毒菌株(M5)缺失其bp26基因的基础上缺失znuA基因得到。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病，由于布鲁菌胞内寄生的特点，防控该病一直是以弱毒疫苗免疫预防为主。目前用于布鲁菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号(S19)弱毒菌株和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号(M5)弱毒菌株和猪型2号(S2)弱毒菌株。这些经典的减毒疫苗株在预防和控制布鲁菌病的蔓延和扩散中起到了重要作用。弱毒苗虽造价便宜，免疫保护持续时间长，免疫保护效率高，但同样存在缺陷，致使人们不敢、不愿也不能对其广泛应用。其主要原因一是弱毒苗在接种后无法区别自然感染和人工免疫，广泛应用将对该病流行病学调查、探查疫源及疾病控制和治疗产生很大的障碍；二是弱毒苗毒性相对较大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。所以研制一种能在临床上区分是自然感染还是人工免疫，免疫保护性能好，毒力弱、安全性能高的布鲁氏菌病弱毒疫苗具有重要的实践意义。此外，布鲁氏菌的生存和增殖必须依赖于环境或宿主之中的多种过渡金属离子。尤其锌离子，是布鲁氏菌结构所必须的金属离子，是菌体内催化反应的辅助因子，因此，获得适当程度的锌对细菌来说非常重要。但是由于宿主体内游离的锌离子含量非常少，为了摄取足够的锌保证细菌自身的新陈代谢，并在宿主体内大量增殖，各种细菌如布鲁氏菌进化出几种类型的蛋白参与摄取和转运锌离子，这些转运锌离子的蛋白操纵系统被命名为ZnuABC，此系统包括ZnuA、znuB、znuC基因编码的多种蛋白，其中ZnuA是一种细胞周质-溶质结合蛋白，目前对该基因的机理研究仍较少，仅推测该ZnuA蛋白与布鲁菌毒力因子相关。其次，BP26蛋白是一种具有强免疫原性的周质蛋白，且几乎存在于所有布鲁菌菌株中，该蛋白具有良好的免疫活性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体，因此常用来作为血清学检验的靶蛋白。为获得一株既能减低毒力、提高安全性，又能维持疫苗的高效免疫原性，且能在临床应用中可进行区分检测诊断的布鲁氏菌病弱毒疫苗，我们将表达BP26和ZnuA蛋白的基因分别敲除，以获得一株羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)重组菌株M5- A bp26_ A znuA及制备方法和应用，为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础，为进一步研究布鲁菌外膜蛋白BP26与金属离子转运蛋白ZnuABC的协同作用提供参考。
技术实现思路
为了克服上述现有疫苗的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一株羊布鲁氏菌重组菌株M5- A bp26- A znuA的制备方法。本专利技术另一目的在于提供通过上述制备方法得到的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Abp26-AznuA。本专利技术再一目的在于提供上述羊布鲁氏菌重组菌株M5- A bp26- A znuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现:一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Abp26_ AznuA的制备方法，包括以下步骤:(I)自杀性同源重组质粒的构建 ①以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis) M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的弓丨物为Pl和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；Pl:5' -GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC~3/ (横线部分为 KpnI 酶切位点)；P2:5' -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；P3:5' -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3'；P4:5' -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'(横线部分为 Sacl 酶切位点)；②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，Pl和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段AznuA ；③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段A znuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段A znuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE- A znuA ；(2)羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选①将自杀性同源重组质粒pRE-AznuA导入羊布鲁氏菌M5_Abp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子JfPCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB-YE)中培养，松弛质粒抗性；②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE- A znuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物Pl和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5- A bp26- A znuA ；步骤(1)①中所述的PCR的条件优选为94°C 2min预变性；98°C 10s,56°C 30s、68°C 1.5min, 30 个循环；68°C 5 ~IOmin 终延伸；步骤(1)②中所述的Overlap PCR的条件优选为94°C 2min预变性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min,30 个循环；68°C 5 ~IOmin 终延伸；步骤(2)①中所述的导入的方式优选为通过电转化方式导入；所述的电转化的条件优选为1mm电极杯，1.8kv，400 Q ；步骤(2)①中所述的氯霉素在所述的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基中的终浓度优选为5 ii g/mL ;步骤(2)①中所述的培养的条件优选为37°C、200r/min摇床上培养18h ；步骤(2)①中所述的PCR鉴定为通过引物Pl和P4进行鉴定；步骤(2)①中所述的PCR鉴定的条件优选如下:94°C 2min预变性；98°C 10s、56°C 30s,68°C 3min，30 个循环；68°C 5 ~IOmin ；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株羊布鲁氏菌重组菌株M5?Δbp26?ΔznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）自杀性同源重组质粒的构建①以羊布鲁氏菌（Brucella?melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；P1：5′?GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC?3′；P2：5′?TCGCTGAAAGACTGCCTGT?3′；P3：5′?GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC?3′；P4：5′?AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC?3′；②利用Overlap?PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE?ΔznuA；（2）羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选①将自杀性同源重组质粒pRE?ΔznuA导入羊布鲁氏菌M5?Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA?YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB?YE中培养，松弛质粒抗性；②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA?YE?Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE?ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA?YE?Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5?Δbp26?ΔznuA；所述的TSA?YE?Sucrose选择培养基的组成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7%的蔗糖。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，马思思，刘翠翠，吴云燕，王佳莹，赵明秋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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