一种制备凝血酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种从动物血液以及人血液中提取凝血酶的方法。该方法是利用层析介质从血浆中吸附凝血酶原，对层析柱进行洗脱，活化凝血酶原，得凝血酶溶液，经超滤浓缩，最后冻干得凝血酶成品。该方法在常温常压下进行，工艺环保，生产周期短，凝血酶提取效率高，一般每升血浆能提取５万ＩＵ以上的凝血酶产品；操作简单，本发明专利技术仅需离心、上样层析、超滤和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其是以动物血液为原料制备凝血酶的方法。
技术介绍
目前国内外主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物。凝血酶是一种蛋白质，其制备方法一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和冻干(或制剂)。我国专利ZL92112188、ZL93110426和ZL96103650分别提出了从猪血或者牛血中提取凝血酶的方法，但这些方法都存在着工艺流程复杂、生产周期长和收率低等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺流程简单、生产周期短和收率高的制备凝血酶的方法。本专利技术制备凝血酶的方法包括以下几个步骤(1)、向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；(2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析，用洗脱剂对层析柱进行洗脱，洗脱液即为凝血酶原溶液；(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠，在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐；(4)、在常温常压下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；(5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；(6)、将凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。本专利技术制备凝血酶的方法中，所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。所述抗凝剂可以是柠檬酸三钠溶液或者草酸钾溶液。使用柠檬酸三钠抗凝剂，浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。使用草酸钾抗凝剂，浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。所述的洗脱剂可以是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。氨基酸或者柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01-0.3mol/L。所述的洗脱剂也可以是调节pH值为6-9，以氨基酸为保护剂，以柠檬酸三钠溶液为缓冲液，以氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的混合溶液。所述的活化凝血酶原，是使用CaCl2为活化剂，直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，在常温常压下活化1-3小时得凝血酶溶液。加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca2+的终浓度为0.05-0.15mol/L。本专利技术具有如下优点 1、本专利技术提供的凝血酶提取纯化方法在常温常压下进行；2、凝血酶提取效率高。一般每升血浆能提取5万IU以上的凝血酶产品；3、操作简单，易实现自动化控制。工艺仅需5～6个步骤，包括离心、上样层析、超滤脱盐、活化、超滤浓缩和冻干等几个步骤，这些过程均易实现自动化控制；4、本专利技术环保。工艺彻底摒弃了以往的有机溶剂提纯方法，操作过程中对人员和周围环境不产生危害，工艺末段采取了适当的废物处理措施，废物排放符合国家的环保要求；5、工艺周期短，整个工艺生产仅需3天(包括冻干)左右。具体实施例方式实施例1 采集羊血液2800ml，加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂400ml，离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，用调节pH为8，浓度为0.2mol/L的氨基酸洗脱剂对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液883.2ml，加入1mol/L的CaCl2溶液76.8ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.08mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液960ml，标记为A1。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约5倍左右，得凝血酶浓液190ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。实施例2采集猪血液4300ml，加入0.109mol/L的柠檬酸三钠抗凝剂500ml，离心分离。取上清抗凝血浆1000ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，用调节pH为7，浓度为0.1mol/L的柠檬酸三钠洗脱剂对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液1590ml。对洗脱液进行超滤脱盐，得到凝血酶原溶液1832.1ml。加入1mol/L的CaCl2溶液137.9ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.07mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液1970ml，标记为A2。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约9倍左右，得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。实施例3采集牛血液3200ml，加入0.125mol/L的草酸钾溶液抗凝剂400ml，离心分离。取上清抗凝血浆1500ml。将上述血浆上已平衡好的阴离子层析柱，采用以柠檬酸三钠为缓冲液，以氨基酸为保护剂，以氯化钠为离子增强剂等所组成的洗脱剂，调节pH为7，对层析柱进行洗脱，得凝血酶原的洗脱液1146ml。对洗脱液进行超滤脱盐，得到凝血酶原溶液1440ml。加入1mol/L的CaCl2溶液160ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的终浓度为0.1mol/L，常温常压下活化凝血酶原3小时，得凝血酶溶液1600ml，标记为A3。采用超滤机对凝血酶溶液进行浓缩，浓缩约8倍，得凝血酶浓液200ml。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状凝血酶成品。实施例4 按照《中华人民共和国药典》2000版二部第1056～1057页的有关凝血酶效价标准检测方法，作标准曲线，对上述凝血酶产品A1、A2和A3进行效价检测，采用紫外260nm/280nm检测法进行蛋白浓度检测，检测结果如表1所示。根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果，计算凝血酶比活和得率(IU/L血浆)，其结果如下表所示。凝血酶质量检测及分析结果 权利要求1.，该方法包括以下几个步骤(1)、向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；(2)、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析，用洗脱剂对层析柱进行洗脱，洗脱液即为凝血酶原溶液；(3)、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠，在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐；(4)、在常温常压下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；(5)、将凝血酶溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；(6)、将凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。2.根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于所述的血液是猪血、牛血等动物血液或人血液。3.根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于所述抗凝剂是柠檬酸三钠或者草酸钾。4.根据权利要求3所述制备凝血酶的方法，其特征在于使用柠檬酸三钠抗凝剂，浓度为0.109mol/L的柠檬酸三钠溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。5.根据权利要求3所述的制备凝血酶的方法，其特征在于使用草酸钾抗凝剂，浓度为0.125mol/L的草酸钾溶液与血液的体积比为1∶7-1∶9。6.根据权利要求1所述的制备凝血酶的方法，其特征在于所述的洗脱剂是pH值为6-9的氨基酸或者柠檬酸三钠溶液。7.根据权利要求6所述的制备凝血酶的方法，其特征在于氨基酸或者柠檬酸三钠溶液的浓度是0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备凝血酶的方法，该方法包括以下几个步骤：（１）、向血液中加入抗凝剂，离心分离，取上清抗凝血浆；（２）、将收集所得的上清抗凝血浆上阴离子层析柱层析，用洗脱剂对层析柱进行洗脱，洗脱液即为凝血酶原溶液；（３）、如洗脱剂中使用了柠檬酸三钠，在进行活化之前对凝血酶原溶液进行超滤脱盐；（４）、在常温常压下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；（５）、将凝血酶溶液进行超滤浓缩，得凝血酶浓缩液；（６）、将凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状凝血酶成品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀江，王永成，裴靖，荆强，
申请(专利权)人：黄耀江，
类型：发明
国别省市：11[]