一种凝血酶的提取方法技术

本发明专利技术涉及酶提取领域，公开了一种凝血酶的提取方法，包括：a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液得到抗凝血浆；b、将抗凝血浆经过层析、洗脱后，制得凝血酶原溶液；c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化，制得凝血酶粗液；d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，用磁石对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含氯化钠的Tris‑HCl缓冲液洗涤，再用含氯化钠的Tris‑HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液；e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。本发明专利技术方法提取时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及酶提取领域，公开了，包括：a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液得到抗凝血浆；b、将抗凝血浆经过层析、洗脱后，制得凝血酶原溶液；c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化，制得凝血酶粗液；d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，用磁石对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含氯化钠的Tris?HCl缓冲液洗涤，再用含氯化钠的Tris?HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液；e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。本专利技术方法提取时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。【专利说明】
本专利技术涉及酶提取领域，尤其涉及。
技术介绍
凝血酶是一种专一性很强的丝氨酸蛋白水解酶，能水解血纤维蛋白原的四个Arg-Gly肽键，产生不溶性的血纤维蛋白，使血液变成凝胶而发生凝固。因此凝血酶作为止血剂， 广泛地应用于医药领域中。 目前凝血酶的制备工艺，一般包括以下过程:在动物血浆中加入抗凝剂制得抗凝 血浆，然后通过吸附洗脱、沉淀等方法制得凝血酶原，将凝血酶原激活后，制得凝血酶粗液， 将凝血酶粗液再进一步纯化，干燥后制得粉状凝血酶。 申请号为961036508的中国专利公开了 一种牛凝血酶的提取分离方法:把过量的 枸缘酸钠加入牛血液中，在常规离心分离出的牛抗凝血浆中加入氯化钡溶液，用帆布过滤 出沉淀物，压干，硫酸铵溶液洗脱、盐析、激活，再经CN-S印hadexC-50柱层析制得牛凝血酶。 申请号为2007101564302的中国专利公开了一种凝血酶原分离及其激活的方法， 该方法利用透析或超滤控制凝血酶原粗提液的电导率的方法，使凝血酶原粗提液中的杂蛋 白和凝血酶原在不同的电导率下发生沉淀，从而使凝血酶原和杂蛋白分离。另一方面，选用 碳酸钙作为激活剂对凝血酶原进行激活。 通过上述方法虽然能够从动物血液中提取出凝血酶，但是提取效率较低，提取过 程中凝血酶损失较多，且制得的产品纯度也不够高。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了。本专利技术方法提取 时间短、效率高，提取的凝血酶纯度、比活高。且磁性吸附微球可重复利用，成本低。 本专利技术的具体技术方案为:，包括以下步骤： a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆。 b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用洗脱剂对层析柱进行洗脱后，制得凝 血酶原溶液。 C、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化60-90min，制得凝血酶粗液。 d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，20-40min后用磁石隔着容器 壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05-0.15mol/L氯化钠的pH值为 7.2的Tris-HCl缓冲液洗涤，再用含1.75-2.25mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液 对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液。 e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。 本专利技术采用磁性吸附微球对凝血酶进行亲和吸附纯化，与传统层析法纯化相比， 其对凝血酶的吸附量大，吸附效率高，纯化度高，纯化后的凝血酶比活高，且可减少洗脱液 用量，磁性吸附微球可回收利用，大大降低了成本。 作为优选，步骤a中所述抗凝剂为4_5wt%的柠檬酸钠溶液，且抗凝剂的添加量为 血液体积的4-6%。 作为优选，步骤b中所述洗脱剂为pH值为6-8的柠檬酸钠溶液。 作为优选，步骤c中所述活化剂为氯化钙溶液，所述活化剂添加后钙离子的浓度为 0?2-0?25mol/L。 作为优选，在步骤c制得凝血酶粗液后，在进行步骤d之前，凝血酶粗液还经过泡沫 纯化处理:将凝血酶粗液转移至泡沫分离柱中，对泡沫分离柱的底部进行鼓气，其中，泡沫 分离柱的内径为8-10mm，凝血酶粗液的装载高度为40-60cm，鼓气速率为1.5-2.5L/min，凝 血酶粗液温度为30-40°C ;鼓气后在泡沫分离柱顶部收集泡沫液，并对泡沫液加热灭泡。 本专利技术在步骤c中制得凝血酶粗液后，对其进行泡沫纯化处理，泡沫纯化法方法简 单，无污染、时间短，成本低。其依据表面吸附原理，对液体进行鼓泡后，泡沫分离柱顶部鼓 出泡沫，以泡沫为载体，凝血酶聚集在气液界面(即泡沫表面)上，而其他物质非蛋白物质以 及部分杂蛋白物质仍旧存留在液体中，分离收集泡沫液实现分离，灭泡后即得到纯化后的 凝血酶。再经过后续的纯化后，制得的凝血酶纯度更高，比活更高。 作为优选，凝血酶粗液在转移至泡沫分离柱前，向凝血酶粗液中添加凝血酶粗液 质量1-3%的环糊精并搅拌均匀。 虽然泡沫纯化法具有许多优点，但是对于凝血酶粗液而言，由于其自身的乳化、气 泡性能较差，会造成泡沫纯化过程中的气泡效率低下，纯化时间长，纯化效果降低。如果添 加普通的乳化剂又会带来更多杂质，从而影响纯化度。环糊精的内部具有疏水空腔，而其 表面具有亲水端基，在泡沫纯化前与凝血酶粗液混合并与凝血酶复合后，能够增加液体的 乳化活性，使得液体的起泡性能增加，从而增加回收率。并且在后续过程中，环糊精与凝 血酶容易洗脱分离，对纯度的影响较小。 作为优选，步骤d中所述磁性吸附微球的粒径为20-60微米，包括四氧化三铁磁粉、 包裹于磁粉外表面的复合材料以及与复合材料偶联的配基。在上述磁性吸附微球，四氧化三铁作为磁核，复合材料作为吸附载体，而配基能够 增加与凝血酶的亲和性，提高凝血酶的收率。作为优选，所述磁性吸附微球的制备方法为:将环糊精、壳聚糖溶解于5_7wt% 的乙酸溶液中，制得混合溶液，其中环糊精的浓度为l_2wt%，壳聚糖的浓度为2_4wt% ; 向混合溶液中添加环糊精和壳聚糖总质量0.6-1.0倍的四氧化三铁磁粉，在超声波分散 条件下继续向混合溶液中逐渐滴加混合溶液体积〇. 5-1倍的乳化液;混合溶液充分乳化后， 继续添加乳化后混合溶液体积1-3%的6-lOwt%戊二醛溶液并搅拌均匀，然后用磁石隔着 容器壁对磁粉进行吸附，去除上清液，取固体物质并洗净后制得磁性微球;将磁性微球浸没 于水中溶胀5-10min后取出，按固液比0.75-0.1.25g/mL将磁性微球加入到活化液中，在40-50°C活化0.5-1.5h，取出磁性微球并洗净;将肝素与磁性微球按质量比0.4-0.5:1混合制得 悬浮液，将悬浮液pH值调节至4-5，添加悬浮液体积2-3倍的3wt %的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亚胺，在4°C下静置10_14h，取出磁性微球并洗净后、干燥后，制得磁性吸附微球。本专利技术方法制得的磁性吸附微球，以四氧化三铁为磁核，以环糊精和壳聚糖的 复合材料包裹磁核，在复合材料商偶联上对凝血酶具有亲和性的肝素，制得的磁性吸附微 球，对凝血酶的特异性吸附效果好，吸附量大，吸附效果高;且纯化方法简单，可重复利用， 降低成本。其中，以环糊精和壳聚糖的复合材料作为载体，不仅提高了磁性吸附微球的吸 附容量，而且在前序的泡沫纯化步骤中，环糊精与凝血酶复合后，由于也含有环糊精， 因此其对凝血酶的亲和性进一步增强，使得吸附效率、纯化效果更好。 作为优选，所述乳化液由等体积的吐温-60和无水乙醇组成;所述活化液由lmol/L 的氢氧化钠溶液、二甲基亚砜和环氧氯丙烷按体积比6-8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝血酶的提取方法，其特征在于包括以下步骤：a、向血液中加入抗凝剂，离心分离后取上清液，制得抗凝血浆；b、将抗凝血浆经过阴离子层析柱层析，并用洗脱剂对层析柱进行洗脱后，制得凝血酶原溶液；c、向凝血酶溶液中添加活化剂进行活化60‑90min，制得凝血酶粗液；d、将磁性吸附微球加入到凝血酶粗液中并进行搅拌，20‑40min后用磁石隔着容器壁对磁性吸附微球进行吸附；取出磁性吸附微球后用含0.05‑0.15mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris‑HCl缓冲液洗涤，再用含1.75‑2.25 mol/L氯化钠的pH值为7.2的Tris‑HCl缓冲液对磁性吸附微球进行洗脱，然后用磁石分离收集洗脱液；e、对洗脱液经过透析脱盐和浓缩后，最后经过冷冻干燥制得凝血酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：柯祖敏，泮立珽，吴方策，
申请(专利权)人：浙江丰安生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33