一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，步骤如下：(1)取人凝血酶原复合物，稀释至凝血因子IX为0.8-1.3IU/ml，加入等体积浓度为4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1-2min；(2)再加入与人凝血酶溶液等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，22-28℃条件下孵育4-6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5-0.7mg/ml；(3)在405nm波长条件测定吸光值，每30s-50s测定1次，共测定5-8次；(4)以测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计算1/k的值，即可。本发明专利技术检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法操作简便，重复性好，可定量检测PCCs制品的综合抗凝能力，评价PCCs制品的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法。
技术介绍
人凝血酶原复合物(prothrombin complex concentrates，PCCs)是从健康人血浆中分离制备的一种血浆蛋白制品，主要包含四种凝血因子(coagulation factor，F)，分别为FII、FVII、FIX、FX，此四种凝血因子具有相似的理化性质，同时均需依赖维生素K合成；此外，还含有蛋白C(protein C,PC)、蛋白S(protein S,PS)、蛋白Z(protein Z,PZ)同样依赖维生素K合成的三种抗凝蛋白。自上世纪60年代该制品用于乙型血友病的临床防治以来，由于其成分较为复杂，其临床适应症不断扩大，还可用于先天性或后天获得的FII、FVII、FX、PC、PS缺乏，肝脏疾病所引起的凝血功能紊乱症，长期输注FⅧ机体产生抗FⅧ抗体的甲型血友病及外伤引起的严重失血的治疗，近年来又扩大至服用双香豆素抗凝药物过量而引起的出血症的治疗。我国人口基数大，肝病患者人群比例高，再加上高纯的FII、FVII、FX、PC、PS制剂缺乏，因此PCCs临床应用更广泛。自PCCs制品用于临床以来，有不少关于导致血栓形成并发症的报道，为了减少其血栓性风险，上世纪90年代，不少学者认为在PCCs中加入肝素及抗凝血酶(antithrombin，AT)抗凝血制剂可降低PCCs的致血栓性，但对PCCs中肝素及AT的具体加入量并没有一个硬性的统一标准，并且，国内外厂家大多采用DEAE-sephadex A50凝胶进行PCCs分离，但具体工艺条件并不相同，导致其含有的PC、PS、PZ也不一致，加之肝素及AT加入量没有一个统一标准，导致PCCs中抗凝成分(PC、PS、PZ、肝素及AT)含量有很大差异，从而致使PCCs的抗凝能力也有很大不同。目前，生物制品的抗凝能力通常通过检测抗凝物质的活性含量来衡量。然而，由于不同工艺及统一标准的缺乏使不同PCCs中抗凝成分(PC、PS、PZ、肝素及AT)含量不一致，且其与促凝成分FII、FVII、FIX、FX混杂在一起。因此，PCCs制品的抗凝能力检测非常复杂，且综合抗凝能力很难评价，进而无法确定PCCs制品的血栓发生风险。急需寻找一种能够测定PCCs综合抗凝能力的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，可以测定PCCs综合抗凝能力。本专利技术检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，它包括如下步骤：(1)取人凝血酶原复合物，稀释至FIX为0.8-1.3IU/ml，加入等体积浓度为4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1-2min；(2)再加入与人凝血酶等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，22-28℃水浴条件下孵育4-6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5-0.7mg/ml；(3)在405nm波长条件测定吸光值，每30-50s测定1次，共测定5-8次；(4)以上述测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计算1/k的值，即可。室温：25℃±5℃。优选地，步骤(1)中，稀释至凝血因子1-1.2IU/ml。优选地，步骤(1)中，人凝血酶溶液的浓度为5IU/ml。优选地，步骤(1)中，室温放置的时间为2min。优选地，步骤(2)中，所述凝血酶发色底物为CS-01(38)，其分子式为H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl。优选地，步骤(2)中，所述孵育的温度是26℃。优选地，步骤(2)中，所述孵育的时间是6min。优选地，步骤(2)中，所述发色底物溶液的浓度为0.6mg/ml。优选地，步骤(3)中，每40-50s测定1次。优选地，步骤(3)中，共测定5-6次。为了能准确衡量人凝血酶原复合物的抗凝能力，研究人员目前致力于其抗凝成分(如PC、PS、PZ、肝素、AT)的单一活性含量测定，然而其整体抗凝能力却无法评价。然而，本专利技术人意外的发现，采用本专利技术方法可以直接检测人凝血酶原复合物的整体抗凝能力，而无需检测每个抗凝物质的活性含量，取得了意料不到的技术效果。专利技术人在研究过程中发现，采用本专利技术方法，将人凝血酶原复合物与凝血酶及其底物在本专利技术特定条件下反应，在特定的时间段内，吸光值(OD值)的变化快慢与人凝血酶原复合物的抗凝能力呈线性负相关，而吸光值与时间的线性方程中的斜率就是反应吸光值的变化快慢的参数，因而通过计算该斜率的倒数，就可以确定人凝血酶原复合物的抗凝能力。本专利技术检测人凝血酶原复合物的方法操作简便，重复性好，可定量测定PCCs制品的综合抗凝能力，从而可对不同PCCs制品的安全性进行评价及比较。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1不同肝素及AT含量的PCCs制品测定的OD值随时间(s)变化曲线及线性方程图2国内外四种PCCs制品测定的OD值随时间(s)变化曲线及线性方程具体实施方式凝血酶原复合物(PCCs)，购自国内外制品公司；人凝血酶，购自sigma公司，批号：SLBK7230V；凝血酶发色底物CS-01(38)，购自HYPEN-biomed公司，批号：30401-1。实施例1本专利技术检测方法1.人凝血酶原复合物(PCCs)制品的稀释将PCCs制品用纯水稀释至0.8IU FIX/ml，取40μl加入微孔板中。2.PCCs与人凝血酶混合取40μl浓度为4IU/ml的的人凝血酶，加入上述微孔板中，轻微震荡，混合均匀，室温放置1min。3.显色反应上述微孔板中加入40μl浓度为0.5mg/ml的发色底物CS-01(38)(分子式：H-D-Phe-Pip-Arg-pNa·2HCl)溶液，混合均匀，22℃水浴条件下孵育4min。4.吸光度测定405nm波长条件测定吸光值(OD值)，每30s测定1次，测定5次，共150s。5.线性方程建立以上述测定的OD值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制OD值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率。6.综合抗凝能力的定量计算计算1/k值，即为PCCs综合抗凝能力。...

【技术保护点】
一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，其特征在于：它包括如下步骤：(1)取人凝血酶原复合物，稀释至凝血因子IX为0.8‑1.3IU/ml，加入等体积浓度为4‑6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1‑2min；(2)再加入与人凝血酶溶液等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，22‑28℃条件下孵育4‑6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5‑0.7mg/ml；(3)在405nm波长条件下测定吸光值，每30s‑50s测定1次，共测定5‑8次；(4)以测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计算1/k的值，即可。

【技术特征摘要】
1.一种检测人凝血酶原复合物抗凝能力的方法，其特征在于：它包括如
下步骤：
(1)取人凝血酶原复合物，稀释至凝血因子IX为0.8-1.3IU/ml，加入
等体积浓度为4-6IU/ml的人凝血酶溶液，混匀，室温放置1-2min；
(2)再加入与人凝血酶溶液等体积的凝血酶发色底物溶液，混匀，
22-28℃条件下孵育4-6min，所述发色底物溶液的浓度为0.5-0.7mg/ml；
(3)在405nm波长条件下测定吸光值，每30s-50s测定1次，共测定
5-8次；
(4)以测定的吸光值为纵坐标(y)，以时间(s)为横坐标(x)，绘制
吸光值随时间变化的趋势，并建立线性方程y＝kx+a，其中k为斜率，计算
1/k的值，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，稀释至凝
血因子1-1.2IU/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海军，田倩，辛叶，叶生亮，李长清，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51