重组型凝血酶原的制造方法、载体DNA及试剂盒技术

本发明专利技术提供重组型凝血酶原的制造方法。所述制造方法包括提供整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA的步骤、及在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原的步骤。

【技术实现步骤摘要】
重组型凝血酶原的制造方法、载体DNA及试剂盒 【
】 本专利技术涉及重组型凝血酶原的制造方法、载体DNA及试剂盒。 【
技术介绍
】 凝血酶原是在肝脏产生的分子量约72, 000的凝血酶前体蛋白质，也被称为血液 凝固第II因子。凝血酶原，在活体内，被活化第X因子、活化第V因子、磷脂及钙离子的复合 物限制性分解，转变为凝血酶。凝血酶是在血液凝固反应中将纤维蛋白原限制性分解而生 成纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶，是与止血或创伤治愈等相关的重要的蛋白质。因此，凝血酶不 仅在临床领域用作止血剂或血液检查用试剂，还在分子生物学领域等中用作研究用试剂。 凝血酶在血浆中大量存在，因此制剂或试剂用凝血酶主要以人或牛的血浆作为原 料制备。但是，在这些的原料中有混入肝炎病毒或人免疫缺陷病毒、异常朊病毒等的感染性 物质的危险性。另外，由于血浆是天然来源原料，所以制品的批间差异成为问题。 因此，近年研究一开发了从由利用大肠杆菌或哺乳动物细胞的基因重组技术 制备的凝血酶原或前凝血酶制造凝血酶的方法(特开2002-306163、US2004/197858、 US2009/137001)。 【
技术实现思路
】 本专利技术的范围仅由随附的权利要求定义，且不受此专利技术概述部分的任何限制。 将凝血酶原或前凝血酶用大肠杆菌表达时，已知其几乎全部成为被称为包涵体的 不溶性凝集体。从而，将回收的不溶性凝集体用变性剂使之可溶之后，有必要进行重折叠 处理。但是，已知重折叠处理不仅烦琐，而且如凝血酶原或前凝血酶这样的复杂结构的蛋 白质的重折叠效率极其低下。另外，担心用从通过重折叠处理而可溶的凝血酶前体得到的 凝血酶的比活性(每单位重量的活性）低。例如，在SoejimaK等人（J. Biochem. vol. 130, p. 269-277, 2001)中记载了从由大肠杆菌表达系统得到的前凝血酶2制备凝血酶，显示通 过重折叠处理而可溶的蛋白质之中有4?7%左右为有酶活性的凝血酶。即，从通过重折叠 处理而可溶的凝血酶前体得到的凝血酶的比活性是血浆来源的天然型凝血酶的4?7%左 右。 利用哺乳动物细胞的表达系统时可得到可溶性的凝血酶原或前凝血酶，但从工业 规模制造的观点来看，存在产量非常少，另外制造成本也高的问题。 另一方面，用利用大肠杆菌或哺乳动物细胞的表达系统可表达向希望得到的蛋白 质融合了功能性标签蛋白质的重组型蛋白质。例如，作为重组型蛋白质的纯化用标签，有 6XHis标签、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)标签、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白质（MBP)标签等。 另外，近年开发了提高重组型蛋白质的表达量或可溶性的标签蛋白质。例如，已知MBP标签 或低分子泛素样修饰因子（SUM0)标签等是提高蛋白质的可溶性的标签，在利用大肠杆菌或 酵母的表达系统中，重组型蛋白质的可溶性得到改善（US2009/305342，US2007/037246 )。 但是，已知存在下述情况：即使融合有可溶性标签的蛋白质整体保持可溶性，但目 的蛋白质部分不能形成正确的构象，进而该蛋白质不具有原本的活性。这样一来，通过融合 可溶性标签而看起来成为可溶性的重组型蛋白质，存在一旦切断可溶性标签，就成为不溶 性凝集体或失去活性的情况。 鉴于如上述一样的情况，本专利技术人等以提供满足下述两方面条件的重组型凝血酶 原的制造方法为课题：可简便并且大量地制造可溶性的凝血酶原，和从得到的凝血酶原转 变的凝血酶有高的比活性。 本专利技术人经锐意探索，结果发现通过将融合有特定标签的凝血酶原在利用鳞翅目 昆虫的表达系统中表达，可简便并且大量地得到可溶性的凝血酶原，从得到的凝血酶原转 变的凝血酶有高的比活性，从而完成本专利技术。 即，本专利技术提供重组型凝血酶原的制造方法。此方法包括：提供整合有编码选自 MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA的步骤、及在鳞翅目昆 虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原们步骤。 另外，本专利技术提供整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶 原的基因的载体DNA。 另外，本专利技术提供试剂盒。此试剂盒包含：含有凝血酶的凝血酶试剂、及用于稀释 受试者的血浆的稀释用缓冲液。此凝血酶从使用整合有编码选自MBP、SUM0及NusA的标签 的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA，在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中 表达的融合有标签的凝血酶原取得。 通过本专利技术，使简便并且大量地制造可溶性的重组型凝血酶原变得可能。从而，通 过本专利技术，无需进行不溶性凝集物的重折叠处理。另外，通过活化得到的重组型凝血酶原， 可得到有与天然型凝血酶大致等同程度的比活性的重组型凝血酶。 【【附图说明】】 图1是显示从表达本专利技术的融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹 制备的样品中的凝血酶原的表达量的照片。 图2是显示可溶性级分中含的本专利技术的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的 图。 图3是显示从融合有标签的凝血酶原及天然型凝血酶原得到的凝血酶的比活性 的图。 图4A是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。 图4B是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。 图4C是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。 图4D是显示从表达融合有标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样品中的凝血酶原的表 达量的照片。 图5是显示可溶性级分中含的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的图。 图6是显示从表达融合有标签的凝血酶原或无标签的凝血酶原的蚕蛹制备的样 品中的凝血酶原的表达量的照片。 图7是显示可溶性级分中含的融合有标签的凝血酶原的量的相对比的图。 图8A是显示使用实施例3中制备的本专利技术的试剂制成的标准曲线的图。 图8B是显示用实施例3中使用的对照试剂制成的标准曲线的图。 图9A是显示实施例3中制备的本专利技术的试剂的保存稳定性的图。 图9B是显示实施例3中使用的对照试剂的保存稳定性的图。 【实施方式】 以下参照【附图说明】本专利技术的优选的实施方式。 在本专利技术的凝血酶原的制造方法（以下，简称为制造方法）中使用整合有编码选 自MBP、SUM0及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因的载体DNA。 MBP是有约42kDa的分子量的蛋白质，已知与革兰氏阴性菌中的麦芽糖糊精的输 送相关。在本专利技术的实施方式中，编码MBP的基因只要是编码作为重组蛋白质的标签而为 公众所知的MBP蛋白质或其衍生物的分离的基因就不特别限定，但优选为编码大肠杆菌 (E. coli)来源MBP的基因，更优选为编码SEQ ID N0:1所表示的氨基酸序列的基因。 SUM0是也被称为Sentrin、SMT3、PICl、GMPl及UBL1的泛素样蛋白质的一种，已知 在从酵母至包括人的脊椎动物中高度保守。在本专利技术的实施方式中，编码SUM0的基因只要 是编码作为重组蛋白质的标签而为公众所知的SUM0蛋白质或其衍生物的分离的基因就不 特别限定，但优选为编码酵母SUMO (SMT3)、人SUM0-3或SUMOstar (改性SUM0、LifeSensor 公司）的基因，更优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组型凝血酶原的制造方法，其包括：提供下述载体DNA的步骤，所述载体DNA整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的基因和编码凝血酶原的基因、和在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原。

【技术特征摘要】
2013.03.15 JP 2013-053566;2014.01.24 JP 2014-011411. 重组型凝血酶原的制造方法，其包括： 提供下述载体DNA的步骤，所述载体DNA整合有编码选自MBP、SUMO及NusA的标签的 基因和编码凝血酶原的基因、和 在鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞中表达融合有标签的凝血酶原。2. 权利要求1的方法，还包括下述步骤： 从上述表达步骤得到的上述鳞翅目昆虫或上述鳞翅目昆虫的培养细胞获得含上述融 合有标签的凝血酶原的可溶性级分。3. 权利要求1的方法，其中 在上述载体DNA中，编码上述标签的基因以上述标签融合到凝血酶原的N末端侧的方 式整合。4. 权利要求1的方法，其中 上述载体DNA整合有编码SEQ ID N0:7?9中任一个所示的氨基酸序列的基因。5. 权利要求1的方法，其中 在上述表达步骤中，上述融合有标签的凝血酶原在上述鳞翅目昆虫中表达。6. 权利要求1的方法，其中 在上述表达步骤中，上述融合有标签的凝血酶原在上述鳞翅目昆虫的蛹中表达。7. 权利要求1的方法，其中 上述鳞翅目昆虫是蚕。8. 权利要求1的方法，其中 上述表达步骤包括用以上述载体DNA重组了的杆状病毒转染上述鳞翅目昆虫或上述 鳞翅目昆虫的培养细胞的步骤。9. 权利要求1?8中任一项的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：坂东孝彦，菅井睦美，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP