本发明专利技术涉及有关生成和使用凝血酶的方法、装置和组合物。所述方法包括通过从液体中沉淀纤维蛋白原来制备包含凝血酶的溶液，所述液体包含全血或血液级分。从所述液体中除去所沉淀的纤维蛋白原，以形成沉淀后液体，所述沉淀后液体与钙、多个珠一起孵育以形成凝块。将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离。由此制备的凝血酶可用作组织封闭剂，以及用在给对象施用组织封闭剂(包括施用自体组织封闭剂)的方法中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从血液或血液级分中分离凝血酶的方法，包括用这种方法产生的组合物和施用这些组合物的方法。
技术介绍
全血，如人的全血，含有多种蛋白质、细胞以及其他成分。例如，全血可分离为血液级分如富血小板血浆和贫血小板血浆。全血和血浆级分包含各种凝血因子，如凝血酶,这些凝血因子可形成凝块来愈合组织或皮肤的损伤或别的破口。凝血酶是能够活化多种凝血因子并且可活化血小板的多功能丝氨酸蛋白酶。凝 血酶可通过活化的因子X(Xa)对凝血酶原上两个位点的酶切由凝血酶原产生。因子Xa的活性可通过与活化的因子V(Va)结合而增强，其称作凝血酶原复合物。一旦形成，凝血酶介导的纤维蛋白原通过蛋白水解而消化为纤维蛋白单体，启动了可导致凝块形成的反应级联，这通常是伤口愈合的第一步。凝血酶还可作为伤口愈合所涉及细胞的化学吸引剂(chemo-attractant)发挥功能,所得纤维蛋白网络具有很多的功能,其包括作为产生胶原蛋白的成纤维细胞的支架、增加吞噬作用、促进血管发生、以及结合生长因子，其可进一步支持愈合过程提供。血小板也可从非结合模式活化为结合模式。作为促凝血物质，凝血酶在制止出血(即生理止血)中发挥重要作用。凝块形成的速率可依赖于凝血酶和纤维蛋白原的浓度。因为其在凝块形成中的重要作用，凝血酶可用作组织封闭剂(tissue sealant)或粘合剂,也可与纤维蛋白原联合使用。包括凝血酶的伤口封闭剂的应用有很多，其包括在下列中的使用皮肤移植、神经外科、心脏外科、胸外科、血管外科、肿瘤外科、整形外科、眼外科、矫形外科、创伤外科、头颈外科、妇科及泌尿外科、胃肠外科、口腔外科、药物递送、组织工程、以及牙体窝洞(dentalcavity)止血等。
技术实现思路
本专利技术包括涉及从血液和/或血液级分中分离凝血酶的方法、装置和组合物，例如，其中所述分离的凝血酶可用作自体凝血因子。制备包含凝血酶之溶液的方法包括从液体中沉淀纤维蛋白原，所述液体包含全血或血液级分(如贫血小板血浆)。从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原，以形成沉淀后液体。除去沉淀的纤维蛋白原的方法包括过滤所述液体或离心所述液体以使沉淀的纤维蛋白沉积下来。然后，将所述沉淀后液体与钙和玻璃珠一起孵育以形成凝块，将包含凝血酶的溶液与凝块分离。提供包含凝血酶的溶液和组合物，其包含按照本方法制备的凝血酶。向对象之部位施用组织封闭剂的方法中可包括这些溶液和组合物。例如，包含凝血酶的溶液根据本文所述方法制备。然后，将凝血酶施用到对象的所述部位。在某些情况下，使用包含获得自对象的全血或血液级分的液体来制备凝血酶，从而提供对所述对象来说为自体的凝血酶。在施用组织封闭剂中凝血酶的施用还可包括向对象的部位施用纤维素蛋白原和钙。附图说明图I是根据本专利技术制备包含凝血酶的溶液之方法的图示。图2是根据本专利技术制备包含凝血酶的溶液之另一个方法的图示。图3是根据本专利技术制备包含凝血酶的溶液之另一个方法的图示。图4是根据本专利技术的方法分离血液级分的示例性装置的局部横截面图。图5A和图5B分别是根据本专利技术的方法制备包含凝血酶的溶液之装置的等轴测视图(isometric view)和局部横截面图。 应当指出这里给出的附图意在示例本专利技术中材料和方法的一般特征，目的是描述某些实施方案。这些附图可能没有精确反映任何给定实施方案的特征，并且也不一定意在限定或限制本专利技术范围内的特定实施方案。具体实施例方式以下对技术的描述仅仅是根据一项或多项专利技术的主题、制造和用途之本质的示例，而不是意在限制本申请或者可以要求本申请优先权而申请的其他申请或者这些申请所授专利权中所要求保护的任何具体专利技术的范围、应用或用途。在“具体实施方案”末尾提供了意在帮助理解本专利技术的对术语和短语的非限制性讨论。本专利技术涉及从全血和/或血液级分中分离凝血酶的方法，以及包含用所述方法生产的凝血酶的组合物，如组织封闭剂。本专利技术还提供了向对象的部位施用包含凝血酶的组织封闭剂的方法。例如，所述组织封闭剂可包含与纤维蛋白原混合的凝血酶，其被施加以形成凝块或纤维蛋白胶(fibrin glue)。凝血酶也可用于在治疗点使多种血液成分凝固，其中血液成分包括纯化的纤维蛋白原、全血、富血小板血衆(platelet-rich plasma,PRP)、贫血小板血衆(platelet-poor plasma,PPP)或其浓缩物,和其组合。凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白，形成可用做封闭剂(sealant)的凝块。可施加所述凝块以封闭手术后的切口部位或者封闭创伤，例如还可促进所述部位处的愈合。在某些情况下，这些凝血酶对于所述对象来说可以是自体的。本专利技术从血液和血液级分中分离凝血酶的方法可提供具有改善的凝血酶酶活性的凝血酶。其他产生或分离凝血酶的方法可导致活性低于期望的凝血酶。例如，一些方法提供了下述凝血酶，其可使得富血小板血浆凝固但不提供足以凝固其他产物(如浓缩血浆或骨髓抽吸物)的凝血酶活性。然而，本方法包括两个步骤来产生凝血酶纤维蛋白原沉淀和凝块形成/凝血酶原向凝血酶转化，其产生包含活性足以有效凝固此类产物的凝血酶的溶液。参看图I,以示意图的形式显示了制备包含凝血酶之溶液的方法100。从包含全血和/或血液级分的液体中沉淀纤维蛋白原，除去所沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体。例如，全血或血液级分Iio与有机溶剂120合并以沉淀纤维蛋白原,如130所示。沉淀纤维蛋白原可包括将全血和/或血液级分110与有机溶剂120混合，以及另外孵育一段时间，比如约10分钟至约20分钟。液体110可包含全血。当在方法100中使用全血时，所述全血可以与抗凝血剂合并。合适凝血剂的实施例包括酸-朽1檬酸盐-葡萄糖(Acid Citrate Dextrose, ACD),其是柠檬酸、柠檬酸钠和葡萄糖的水溶液，可用来保存血液。在某些实施方案中，所述血液成分可包含A⑶-A，其每IOOOml包含总柠檬酸盐(以柠檬酸计，无水(C6H8O7))约20. 59g至约22. 75g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)约 23. 28g 至约 25. 73g 和钠(Na)约 4. 90g 至约 5. 42g。在一些实施方案中，使用A⑶-B，其每IOOOml包含总柠檬酸盐(以柠檬酸计，无水(C6H8O7))约 12. 37g 至约 13. 67g，葡萄糖(C6H12O6 * H2O)约 13. 96g 至约 15. 44g 和钠(Na)约 2. 94g至约3. 25g。在某些实施方案中，可使用约1/10体积至约1/7体积的A⑶-A对全血进行抗凝血处理。其他合适的抗凝血剂包括本领域所知道的，如肝素、柠檬酸磷酸葡萄糖(citratephosphate dextrose,CPD)和乙二胺四乙酸(EDTA)。这些抗凝血剂可以放在用于从对象抽血的注射器中，或者也可以在抽血后与血液混合。抗凝血剂通常包括螯合剂(如，柠檬酸，EDTA)来螯合游离钙离子。在某些实施方案中，所述液体110为血液级分，合适的血液级分包括贫血小板血浆。血液级分110可通过多种合适方法中的任一种得到，包括本领域知道的那些。可用来制备血液级分110的装置的一个实例在图4中显示。在这种情况下，装置400包含容器405， 如管，其在装满血液后放置在离心机中。容器405包含浮标系统，所述系统具有本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于制备包含凝血酶的溶液的方法，所述方法包括：从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原；从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体；将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块；和将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离。
【技术特征摘要】
2011.05.02 US 13/099,0871.用于制备包含凝血酶的溶液的方法，所述方法包括 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原； 从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体； 将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块；和 将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离。2.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体包含贫血小板血浆。3.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体还包含抗凝血剂。4.根据权利要求3的方法，其中所述抗凝血剂包括酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液。5.根据权利要求I的方法，其中所述沉淀步骤包括向所述包含贫血小板血浆或全血的液体中添加有机溶剂。6.根据权利要求5的方法，其中所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮或其组合。7.根据权利要求I的方法，其中所述孵育步骤包括孵育约5分钟至约10分钟。8.根据权利要求I的方法，其中所述包含贫血小板血浆或全血的液体还包含螯合剂，并且钙以大于所述螯合剂可结合之量的量存在。9.根据权利要求I的方法，其中所述珠包括玻璃珠、聚苯乙烯珠或其组合。10.根据权利要求I的方法，其中将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离包括离心所述凝块和取出作为包含凝血酶之溶液的一部分上清。11.根据权利要求I的方法，其还包括以下步骤中的至少之一向所述包含凝血酶的溶液中加入甘油、多羟基化合物或醇；向所述包含凝血酶的溶液中加入螯合剂以螯合钙；将所述包含凝血酶之溶液的PH调节到低于7 ;以及降低所述包含凝血酶之溶液的温度。12.根据权利要求I的方法，其中 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原包括向贫血小板血浆中添加乙醇； 从所述液体中除去沉淀的纤维蛋白原以形成沉淀后液体包括过滤所述液体； 将所述沉淀后液体与钙和多个珠一起孵育以形成凝块包括将所述沉淀后液体、氯化钙和珠混合；和 将包含凝血酶的溶液与所述凝块分离包括将所述凝块离心并取出作为包含凝血酶之溶液的一部分上清。13.根据权利要求I的方法，其中 从包含贫血小板血浆或全血的液体中沉淀纤维蛋白原包括将贫血小板血浆或全血抽吸到含有乙醇的注射器中，其中当所述液体包含全血时，所述注...
【专利技术属性】
技术研发人员：希拉里·奥弗霍尔泽，珍妮弗·E·沃德尔马伊，
申请(专利权)人：拜欧米特生物制剂有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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