一种重组载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组载体及其应用，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术重组载体将慢病毒表达载体作为基因治疗载体，带上改造后的CAR19嵌合抗体，可有效地感染各种类型的细胞，尤其是一些难转染的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种重组载体及其应用。
技术介绍
B细胞淋巴瘤(melanoma)为最常见的恶性淋巴瘤之一，占比约为85％。随着诊断和治疗模式的不断改进，虽然B细胞淋巴瘤经当前普遍采用的规范化治疗后有着较高的缓解率，但仍有20％-30％患者死于肿瘤耐药所致的复发和难治性B细胞淋巴瘤。因此，寻找与应用B细胞淋巴瘤新的分子靶点也就成为了当前淋巴瘤基础和转化研究领域的重点和焦点问题。手术、放疗和化疗等作为恶性肿瘤的传统治疗方法，在抗肿瘤治疗中一直占据着主导地位。近十年来，随着对肿瘤发生发展的内在机制及其外在微环境研究的不断深入，免疫治疗尤其是细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的应用逐渐从幕后走到了台前。免疫治疗具有突破肿瘤耐药的遗传学和细胞系机制、靶向肿瘤细胞的同时极少损伤正常组织的特点。近年来，可以激活机体T细胞杀伤功能的单克隆抗体和经基因修饰后可直接识别肿瘤细胞的效应细胞，在临床抗肿瘤试验中体现出明显强于既往研究的显著疗效，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，不能被T细胞识别，而无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，首先必须需要肿瘤相关抗原的表达和呈递，以及共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术是目前在进行大规模临床试验的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T的核心部件是CAR，CAR一般包括一个肿瘤相关抗原结合区，通常来源于肿瘤相关抗原的单克隆抗体scFV段；一个胞外铰链区；一个跨膜区和一个胞内刺激信号区。CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。细胞外有N端及两个C2-Ig区，一个跨膜区，细胞内有C端及含9个酪氨酸残基的高度保守功能区。CD19通过B细胞受体(Bcellreceptor，BCR)依赖和非依赖方式调节B细胞的发育、增殖和分化。CD19最早出现在晚期祖B细胞(latepro-Bcell)和早期前B细胞(earlypre-B)，正好在免疫球蛋白重链基因重组之前，在B细胞成熟并最终分化为浆细胞的整个过程中都有表达。临床研究显示所有的急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)和慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)均表达CD19，表达的程度可能在白血病及淋巴瘤亚型之间不同。最新研究表明，CD19通过稳定细胞中c-Myc的浓度，以BCR非依赖方式在B细胞恶性转化中发挥作用。CD19作为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点基于以下几点。首先，CD19只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达；其次，CD19在B细胞恶性转化过程中不丢失，难治/复发性病例仍然有效；再者，CD19在造血干细胞和pro-B细胞不表达，治疗停止后，B细胞可以得到有效地补充。CAR19全称为抗CD19的嵌合抗原受体DNA序列(anti-CD19CAR,CAR19或αanti-CD19-BB-ζ)，是为了治疗B细胞恶性肿瘤，如：慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)而设计的靶向性结合CD19的DNA序列。CN104788573A公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。但该嵌合抗原受体的灵活度较低，信号转导较弱。
技术实现思路
针对目前嵌合抗原受体的灵活度较低，信号转导较弱的情况，本专利技术提供一种重组载体及其应用，所述载体可以表达大量的CAR19，可以增加肿瘤免疫治疗的靶向性。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种重组载体，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列(如SEQIDNO.1所示；所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列见序列表。本专利技术中，所述慢病毒载体pCDH可用现有技术中存在的慢病毒载体pCDH即可。本申请是包括信号肽(CD8leader)、抗原结合结构域(scFv)、跨膜结构域(CD8hinge)、胞内共刺激区信号传导区(4-1BB)和信号传导结构域(CD3ζ)抗原受体序列，通过用慢病毒承载CAR19转染T细胞产生Anti-CD19CAR-T从而能够特异性增强识别肿瘤抗原能力，并激发T细胞自身发挥抗肿瘤能力。优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19由CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、胞内结构域串联而成，所述抗CD19的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述SEQIDNO.2所示的氨基酸序列如下：EFMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-GS.优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述SEQIDNO.3所示的核苷酸序列如下：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19由CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、胞内结构域串联而成，所述抗CD19的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19中的CD8跨膜结构域和胞内结构域之间用连接肽连接；优选地，所述胞内结构域由4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区组成，所述4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区之间用连接肽连接。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述连接肽的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。6.一种如权利要求1-5中任一项所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦丹，李德志，连杰，赵礼军，付苏雷，吴雷振，
申请(专利权)人：河南省华隆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41