表达载体及重组细胞制造技术

本发明专利技术提供了一种表达载体，其是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，包括EF1α‑IDS序列。该表达载体以EF1α为启动子，能够保证真核基因高效表达，为研究IDS基因的功能提供了良好的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体地，本专利技术涉及一种表达载体以及包括该表达载体的重组细胞，特别地，本专利技术尤其涉及IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体。
技术介绍
慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因的转导效率，且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达。在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒已经成为表达外源基因的常用载体形式之一，并且正在获得越来越广泛的应用。在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。粘多糖贮积症II型(Mucopo1ysaccharidosistypeII，MPSII，MIM309900)，又称Hunter综合征，是一种X连锁隐性遗传病，在人群中的发病率极低，属于一种“罕见病”。由于基因突变导致溶酶体酶艾杜糖-2-硫酸酯酶(iduronate-2-sulfatase，IDS)缺乏，以致粘多糖(mucop01ysaccharides，MPS)在体内大量沉积，尿中大量排出硫酸皮肤素(dermatinsulfateB，DS)、硫酸已酰肝素(heparitinsulfate，HS)。患者出生时表现一般正常，但随着越来越多的粘多糖贮积在体内，MPSII病程进行性加重，症状典型，预后甚差。IDS基因定位于Xq27.3-Xq28，MPSII与IDS基因发生突变高度相关。因此，开发一种可携带IDS基因的慢病毒载体，对于研究IDS基因的功能提供了良好的工具，且为Hunter综合征的慢病毒基因治疗提供了一种较为理想的手段，具有重要的现实意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供了一种可携带IDS基因的慢病毒表达载体以及包括该表达载体的重组细胞。一方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包括EF1α-IDS序列。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。前述的表达载体，所述增强子Kozak的序列是CGCCACC。前述的表达载体，所述EF1α-IDS序列是SEQIDNo:1所示的序列。前述的表达载体，所述表达载体以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列。另一方面，本专利技术还提供了包括上述表达载体的重组细胞。相比于现有技术，本专利技术的技术方案至少具有如下有益效果：(1)本专利技术提供了一种IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，为研究IDS基因的功能提供了良好的工具。(2)本专利技术所述的启动子EF1α，是一种强表达的启动子，可使外源基因在哺乳动物细胞中广泛表达，甚至可在原代细胞和干细胞内表达。(3)本专利技术所述的增强子Kozak，是用来增强真核基因的翻译效率的，是最优化的ATG环境，避免核糖体出现leakyscan。附图说明图1是pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE载体图谱。图2是pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE载体酶切结果。其中，1#:10kbMarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:载体酶切产物3#:未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。图3是EF1α片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。图4是IDS片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。图5是EF1α-IDS片段胶回收电泳结果。其中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp图6是转化子PCR产物电泳图。其中，1#：阴性对照(ddH2O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；5#-12#：IDS1-8号转化子。图7是阳性克隆测序结果。图8是质粒表达检测流程图。图9是Real-timePCR实验数据统计结果。具体实施方式为充分了解本专利技术之目的、特征及功效，借由下述具体的实施方式，对本专利技术做详细说明，但本专利技术并不仅仅限于此。下述具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述具体实施方式中所涉及的物质均为常规市购得到。在此应当说明的是，除非另有说明，否则本专利技术中所涉及的术语具有本领域技术人通常理解的含义。I.表达载体本专利技术的一个方面提供了一种表达载体，该表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体，该表达载体包括EF1α-IDS序列。其中，EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。在一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列包括强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基因之间的增强子Kozak。其中增强子Kozak的序列是CGCCACC。在另一种具体实施方式中，EF1α-IDS序列是序列表中SEQIDNo:1所示的序列：在一种特别优选的具体实施方式中，本专利技术的表达载体是IDS基因过表达慢病毒质粒表达载体pRRLSIN.cPPT.EF1α-IDS.WPRE，如图1所示，其是以慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE为骨架载体，将PGK-GFP序列替换为EF1α-IDS序列(序列表中SEQIDNo:1所示的序列)，即pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE中原有的PGK启动子替换为强启动子EF1α，将原有的GFP基因替换为IDS基因，并在强启动子EF1α和目的基因IDS之间插入增强子Kozak(CGCCACC)。II.表达载体的构建本专利技术表达载体的构建方法主要包括骨架载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括EF1α‑IDS序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括EF1α-IDS序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体；IDS基因；和增强子Kozak或者其功能片段或序列变体；其中，增强子Kozak或者其功能片段或序列变体插入到强启动子EF1α或者其功能片段或序列变体与IDS基因之间。3.根据权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，所述EF1α-IDS序列包括：强启动子EF1α，IDS基因，和插入到强启动子EF1α与IDS基...

【专利技术属性】
技术研发人员：高恩，侯增淼，李晓颖，李敏，杨小琳，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61