具有改进的基因表达能力的表达载体制造技术

本发明专利技术涉及具有改进的基因表达能力的表达载体、由所述表达载体转化的细胞，以及通过使用所述细胞来大量生产靶蛋白的方法。与典型的动物细胞表达载体相比，根据本发明专利技术的表达载体显示出更优异的基因表达能力，因此，可以显著提高异源基因的蛋白质表达。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于改进基因表达的表达载体、由所述表达载体转化的细胞以及通过使用所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。
技术介绍
在大多数情况下，已经通过使用动物细胞进行了治疗性重组蛋白和抗体的生产，并且正在努力提高生产效率。例如，在无血清培养基中预适应的悬浮宿主细胞系已被用于快速选择高生产细胞系(producer cell line)。此外，已经不断开发高表达载体和高生产细胞系以消除或缩短基因扩增所需的时间。还在努力地开发一种通过在细胞系的初始选择中使用自动化的细胞选择装置的有效方法。高生产细胞系显示出30至80pcd的表达水平(甚至是在没有基因扩增时)，并且高生产细胞系可通过使用基于基质附着区(matrix attachment region，MAR)或类似于MAR的普遍存在的染色质开放元件(ubiquitous chromatin opening element，UCOE)的高表达载体而在4个月内制备。最近的研究表明，载体优化对于在六个月内实现3g/L至5g/L的抗体生产率是必需的。最近，对MAR元件(例如双-MAR、多-MAR、反式-MAR等)的优化暗示了生产率提高的可能性，但是仍持续需要可通过引入5’UTR或内含子元件来获得具有改善的生产效率的稳定载体。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供用于大量表达和生产靶蛋白的表达载体。本专利技术的另一个目的是提供由上述表达载体转化的细胞。本专利技术的再一个目的是提供通过使用所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。为了实现如上所述的本专利技术的一个目的，提供了包含可操作地连接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子、支架附着区(scaffold attachment region，SAR)或基质附着区(MAR)元件以及嵌合内含子的表达载体。为了实现如上所述的本专利技术的另一个目的，提供了由上述表达载体转化的细胞。为了实现如上所述的本专利技术的再一个目的，提供了通过培养所述经转化的细胞来大量生产靶蛋白的方法。与常规表达载体相比，根据本专利技术的表达载体显示出优异的基因表达，因此，可以显著提高外源基因的蛋白质表达。附图说明通过本专利技术的以下描述结合所附附图，本专利技术的上述目的和特征以及其他目的和特征将变得明显。图1示出了关于MAR候选元件的萤光素酶(luciferase)载体的示意图。图2示出了MAR候选元件的萤光素酶表达结果。图3示出了比较启动子测试的萤光素酶表达结果。图4示出了关于LCR(基因座控制区(locus control region))候选元件的萤光素酶载体的示意图。图5示出了用于制备Alb E64×4LCR元件的PCR策略。图6和7示出了LCR候选元件的萤光素酶表达结果。图8示出了dCFH(人补体因子H的缺失形式(deletion form of human complementfactor H))的制备过程。图9示出了dCFH在CHO-S细胞中的表达水平。图10示出了dCFH在293-F细胞中的表达水平。图11示出了dCFH在CHO-DG44稳定细胞中的表达水平。图12和13分别示出了FIX表达载体组1的示意图及其表达结果。图14和15分别示出了FIX表达载体组2的示意图及其表达结果。图16示出了嘌呤霉素(Puromycin)表达系统的限制性酶图谱。图17示出了一对新载体pMS-P-MCS和pMS-D-MC的结构。图18A和18B分别示出了用于ER2抗体表达的第一对新载体(“新载体对I”)(pMS-P-ER2LC和pMS-D-ER2HC)以及一对MAR载体(pMSGneo-ER2LC和pMSGneo-ER2HC)的结构。图19示出了用于ER2抗体表达的第二对新载体(“新载体对II”)(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC)的结构。图20A和20B分别示出了一对启动子载体(pS)(pS-P-ER2LC和pS-D-ER2HC)以及一对内含子载体(pSI-P-ER2LC和pSI-D-ER2HC)的结构。图21A和21B分别示出了在CHO贴壁细胞CHO-K1和DG44中ER2抗体的表达水平。具体实施方式在本专利技术中，为了制备用于在CHO(中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary))细胞等中表达外源基因之具有改进生产效率的稳定表达载体，在多种MAR元件、支架附着区(scaffoId attachment region，SAR)元件、基因座控制区(locus control region，LCR)和内含子元件中鉴定出可提高基因表达水平的元件。因此，本专利技术提供了包含可操作地连接的SV40(猿猴病毒40(simian virus 40))启动子、支架附着区(SAR)或基质附着区(MAR)元件以及嵌合内含子的表达载体。如本文所使用的术语“启动子”是指编码区上游(upstream)的非翻译核酸序列，其包含聚合酶结合位点并且对于下游基因具有mRNA转录起始活性。具体地，“启动子”包含通过RNA聚合酶来起始转录的TATA盒或TATA样区域；但并不限于围绕其的区域；并且可包含对于与除RNA聚合酶之外的蛋白质缔合以调控表达而言必需的区域。在本专利技术中，启动子可包括SV40启动子或其变体，优选由SEQ ID NO：12表示的SV40启动子。启动子变体是指这样的变体，其中启动子序列的某一部分通过添加、缺失或替换而被修饰以提高基因表达。根据本专利技术的一个实施方案，与CMV启动子相比，本专利技术的使用SV40启动子的表达载体显示出约4倍的表达提高(参见实施例1-1)。此外，这样的启动子与为外源基因的靶基因可操作地连接；如本文所使用的“可操作地连接(operably linked)”意指调控靶基因表达的核酸序列和编码靶蛋白的核酸序列功能性连接以使得他们可执行一般功能。可使用本领域中已知的重组DNA技术来实现与重组载体的可操作地连接；并且可使用本领域通常已知的酶进行位点特异性DNA切割和连接。在本专利技术中，可包括用于提高基因表达的元件的SAR或MAR元件。可包括SAR或MAR元件来构成表达载体以使得这样的元件可存在于启动子的5’端、3’端或者5’和3’端二者。如本文所使用的“MAR元件”是指暂时将转录活性DNA环状结构域附着至核基质(Nuclear matrix)的DNA序列(Pienta等，(1991)Crit.Rev.Eukaryotic Genne Expres.，1：355-385)，MAR序列的实例在本领域中是已知的。在本专利技术中，为了选择提高基因表达的元件，针对人β-珠蛋白MAR(Yu，J.，Bock，J.H.，Slightom，J.L.和Villeponteau，B.，Gene 139(2)，139-145(1994)，基因库No.L22754)和人CSP-B基因侧翼(flanking)SAR(Hanson，R.D.和Ley，T.J.，Blood，79(3)，610-618(1992)，基因库No.M62716)使用萤光素酶测定(luciferase assay)进行了双重(5’和5’+3’)和顺式+反式相关测试(cis+trans related test)；结果是筛选出某些合乎期望的元件(参见实施例1-1)。上述MAR或SAR元件本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达载体，其包含可操作地连接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子、支架附着区(scaffold attachment region，SAR)或基质附着区(matrix attachment region，MAR)元件以及嵌合内含子(chimeric intron)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.27 KR 10-2013-01653401.表达载体，其包含可操作地连接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子、支架附着区(scaffold attachment region，SAR)或基质附着区(matrix attachmentregion，MAR)元件以及嵌合内含子(chimeric intron)。2.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述SV40启动子由SEQ ID NO：12表示。3.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述SAR元件由SEQ ID NO：39表示，并且所述MAR元件由SEQ ID NO：40或41表示。4.根据权利要求1所述的表达载体，其中所述嵌合内含子由SEQ ID NO：25表示。5.根据权利要求1所述的表达载体，其还包含由SEQ ID NO：15或16表示的基因座控制区(1ocus control region，LCR)元件。6.根据权利要求1所述的表达载体，其中表达受所述启动子调控的靶基因被插入到所述表达载体中。7.权利要求6所述的表达载体，其中所述靶基因选自：因子VII(factor VII，FVII)基因、...

【专利技术属性】
技术研发人员：金正燮，尹成泰，郭曦天，吴美淑，李秀珉，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国;KR