本发明专利技术涉及ＬＫ８－Ｆｃ融合蛋白，其能增加抑制血管生成活性和体内稳定性。更具体地说，本发明专利技术涉及其中具有抑制血管生成活性的ＬＫ８蛋白与人免疫球蛋白ＩｇＧ１的Ｆｃ区域融合的ＬＫ８－Ｆｃ融合蛋白，以及用于治疗癌症的组合物，所述组合物含有该融合蛋白。ＬＫ８－Ｆｃ融合蛋白不仅具有起到抗肿瘤的抑制血管生成活性和抑制转移活性，而且在体内的半衰期非常长，因此可用作更有效和经济的肿瘤治疗剂或者肿瘤抑制剂。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及LK8-Fc融合蛋白，其能增加抑制血管生成 (angiogenesis)活性和体内稳定性，更具体地说，本专利技术涉及其中具有 抑制血管生成活性的LK8蛋白与人免疫球蛋白IgGl的Fc区域融合的 LK8-Fc融合蛋白，以及用于治疗癌症的组合物，所述组合物含有该融合 蛋白。
技术介绍
血管生成指的是通过其由己有血管形成新血管的过程。已经知道在 正常生理条件下，血管上皮细胞保持在难以增殖的状态，并且血管生成 仅仅在极其有限的情况下发生，这包括女性月经周期。在控制血管生成 机制方面的失调可引起许多病理性疾病，包括癌症，糖尿病、视网膜病、 风湿性关节炎、银屑病等。在肿瘤的情况下，众所周知的是虽然在没有 血管的帮助下肿瘤可生长到数mm3的体积，但血管生成对于肿瘤来说是 必须的(N. Eng. J. Med" 333:1757, 1995; Folkman, J" New Engl. J. Med" 285:1182， 1971)。为了幵始肿瘤血管生成，应当满足两个条件，即刺激血管生成因子 的增加和抑制血管生成因子的减少。内源性抑制血管生成因子的典型例 子是血管生长抑制因子(angiostatin)。己经报道血管生长抑制因子是与 血液凝集相关的酶血纤维蛋白溶酶原的一部分，其由kringle结构组成， 并具有在体外和体内条件下抑制血管生成的能力(O'Reilly, M.S.等人, Cell, 79:315, 1994) 。 kringle结构是由大约80个氨基酸和三个分子间二硫键组成的蛋白质结构域并组成独立的折叠单元。kringle结构在许多蛋 白质中被发现，诸如凝血素、尿激酶、肝细胞生长因子和载脂蛋白(a)。 特别是，已经报道各种kringle，诸如凝血素kringle和尿激酶kringle结 构显示了抑制血管生成的能力(Lee, T.H.等人，J. Biol. Chem., 273:28805, 1998; Kim等人,J. Biol. Chem., 278:11449, 2003 )。糖蛋白载脂蛋白(a)与作为低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白成分 的apo B-100共价结合形成脂蛋白(a) (Fless， G.M., J. Biol. Chem., 261:8712,1986)。已知脂蛋白(a)参与胆固醇在体内输送，并且血浆中 脂蛋白(a)的浓度增加与动脉粥样硬化以及心脏疾病有关(Armstrong, V.W.等人，Artherosclerosis, 62:249, 1986; Assmann, G.， Am. J. Cardiol" 77:1179, 1996)。载脂蛋白(a)包括显示与血纤维蛋白溶酶原IV和V 以及失活蛋白酶状结构域同源的两种类型的kringle结构域。根据氨基酸 序列同源性，载脂蛋白(a)kringleIV-结构域被分成10个亚型(IVI-IVIO)， 并且除在各种人类载脂蛋白(a)基因的等位基因中具有3-42个拷贝数 以外的IV2kringle以外，它们中的每个都仅仅具有一个拷贝。最后 kringleV具有与血纤维蛋白溶酶原kringleV 83.5%的同源的氨基酸序列。本专利技术的专利技术人观察到构成载脂蛋白(a)的一部分kringle (kringle KV38，此后称为"LK8蛋白")具有在体外和体内条件下抑制血管生成 的能力，这起到抗肿瘤和抑制肿瘤细胞转移作用(WO 2001/019868,题 为"Angiogenesis inhibitor comprising LK6, LK7， LK8 and LK68" ; WO 2004/073730，题为"Anticancer agent containing LK8")。但是，发现 LK8蛋白在猴子体内仅仅具有7-11小时的半衰期，因此其具有的问题在 于需要以较短的间隔重复给药以便显示抗肿瘤效力。而且，血管生成抑 制因子常常抑制细胞生长而不是对细胞有毒性，并且必须连续给药很长 一段时间才会显示其抗肿瘤效果(Jain, R.K.等人，Nat. Clin. Pract. Oncol., 3:24,2006)。4因此，对于长期连续给药来说，需要大量的LK8重组蛋白的生产和所导致的生产成本的增加，并且高治疗成本和长期治疗时间给患者造成很大的负担。出于这种原因，在技术上难以使用LK8蛋白开发抗肿瘤剂。 同时，为了增加抗原性、纯化的容易性并增加在血液中的半衰期等， 已经进行了免疫球蛋白或其片断与活性蛋白的融合蛋白的制备。这些例 子包括作为蛋白质药物的融合蛋白的白介素受体，其具有免疫球蛋白 片断本身的功能和具有免疫球蛋白Fc的有用蛋白质功能的两种功能(韩 国专利249572);通过将INF-a与Fc融合以便增加INF-a的血液半衰 期得到的融合蛋白等等。然而，虽然INF-a和Fc的融合蛋白具有非常加 长的半衰期，但其缺点在于INF-a的活性被降低(US 5,723,125)。因此，本专利技术的专利技术人付出了许多努力来发现当将LK8蛋白质体内 给药时能够使LK8保持长半衰期的同时其抑制血管生成效果不被降低的 方法。出于这种目的，本专利技术的专利技术人通过将IgGl的Fc区域与LK8蛋 白的C-末端融合构建了 LK8-Fc融合蛋白并检査了其效果。结果，本发 明的专利技术人发现，该融合蛋白显示了完全出乎意料的效果，因为与LK8 蛋白的半衰期相比，由于Fc融合伴侣没有影响LK8蛋白本身的效果， 该融合蛋白的半寿期增加了 40-50倍，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供使用基因融合技术通过将人免疫球蛋白 IgGl的Fc区域与LK8蛋白的C-末端融合得到的具有增加的生物可利用 性的LK8-Fc融合蛋白，所述LK8蛋白的C-末端为具有抗肿瘤和抑制肿 瘤细胞转移效果的人载脂蛋白(a)的kringle片断。本专利技术的另一目的在于提供用于治疗癌症的组合物，所述组合物含 有LK8-Fc融合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供用于抑制血管生成的组合物，所述组合 物含有LK8-Fc融合蛋白。为了实现上述目的，在一个方面，本专利技术提供了 LK8-Fc融合蛋白， 其中将LK8蛋白与人免疫球蛋白IgGl的Fc区域融合。在本专利技术中， LK8-Fc融合蛋白优选包括另外的IgK前导序列以便进行融合蛋白的胞外分泌。在另一方面，本专利技术提供了编码所述LK8-Fc融合蛋白的基因，含 有所述基因的重组载体和使用所述重组载体转染的重组细胞。在本专利技术 中，细胞优选动物细胞。动物细胞优选CHO/LK8-Fc细胞。在又一方面，本专利技术提供了用于治疗癌症的组合物和用于抑制血管 生成的组合物，所述组合物含有所述LK8-Fc融合蛋白。在本专利技术中，癌 症优选自由直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌骨 转移和卵巢癌组成的组中。通过下列详细描述和所附的权利要求书，本专利技术的其他特征和方面 将是非常明显的。附图说明图1显示了构建表达编码LK8-Fc融合蛋白的基因的表达载体 pMSG/LK8-Fc的过程。图2是显示CHO/LK8-Fc细胞系在旋转培养中的生长曲线和细胞生 长能力的示意图。图3是显示在使用亲和层析的LK8-Fc融合蛋白的纯化过程中 LK8-Fc融合蛋白作为甘氨酸缓冲液浓度和时间的函数的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＬＫ８－Ｆｃ融合蛋白，其特征在于：ＬＫ８蛋白与人免疫球蛋白ＩｇＧ１的Ｆｃ区域融合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳贤京，尹烨，安珍衡，任仁焕，李虎政，金长盛，朴斗鸿，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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