本发明专利技术涉及分离自由SEQ?ID?NO:3所示多核苷酸编码的猿腺病毒血清型19的新六邻体、其高变区、含有其的嵌合型腺病毒，及其治疗上的用途，提供了解决使用腺病毒开发基因治疗剂进行安全和有效地系统治疗的问题的方案。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分离自猿腺病毒血清型19(“SAdl9”)的新六邻体，其高变区(“HVR”)，使用其的嵌合型腺病毒及其治疗用途。
技术介绍
腺病毒属于腺病毒科(Adenoviridae)，其于1953年首次分离。根据基因组的相似性、致癌性和血液凝固特性，将人腺病毒分为六(6)个亚属(A至F)。腺病毒感染大多数非分裂细胞如肌肉细胞、肺细胞、脑细胞和心脏细胞，其分子生物学特征为本领域所熟知。腺病毒基因组由35kb的线性、双链DNA组成，其在宿主细胞中的复制依赖于病毒蛋白E1A。通过使用将其ElA删除后的非复制性载体，可对上述腺病毒的特征加以利用。由于插入有腺病毒El基因的HEK293细胞系的研制，腺病毒载体系统已经应用于许多研究中，其导致了利用宿主细胞的细胞毒性的病毒疗法的发展。2005年在中国商业化的融瘤病毒治疗剂安柯瑞(Oncorine' )是E1B55-缺失型腺病毒，其用于在p53-缺失型肿瘤中选择性诱导凋亡性细胞死亡。在开发选择性复制的腺病毒治疗剂的过程中，最重要的是ElA蛋白的选择性表达，已经有很多案例表明使用肿瘤选择性表达启动子与可能的肿瘤-选择性腺病毒基因治疗剂有关。大多数肿瘤-选择性腺病毒是使用通常发现的人腺病毒血清型5( “HAd5”)制备的。据报道，由于HAd5占80%的普遍性，因此人具有高水平的腺病毒中和抗体(Appaiahgari, M. B.等人，(2007)临床及疫苗免疫学(Clinical and VaccineImmunol.) 14，1053-1055)。针对腺病毒衣壳蛋白的这些中和抗体影响腺病毒系统用药的药效和毒性(Chen, Y.等人，(2000)人类基因治疗(Hum. Gene Ther.) 11，1553-1567)。病毒衣壳由三(3)种蛋白即六邻体、纤毛和五邻体组成，其包括具有由240个六邻 体和12个五邻体组成的对称二十面体结构的壳粒(capsomere)。每个五邻体均结合突出的7(Tl00nm的三聚体纤毛。当被腺病毒感染时，三聚体纤毛在腺病毒感染过程中附着于宿主细胞表面膜上的柯萨奇腺病毒受体(CAR)。五邻体的R⑶区结合至整合蛋白，其导致病毒吸附并侵入至宿主细胞内。据报道，六邻体蛋白的环I (LI)和环2(L2)暴露于病毒壳粒结构的外部。LI和L2分别含有六邻体蛋白的六(6)个高变区(HVRs)，即在第132至320个氨基酸内的HVR-I至HVR-6,以及第408至459个氨基酸内的第7个HVR(HVR_7)。腺病毒提供了优良且有效的将治疗基因转入细胞的方式。然而，使用腺病毒载体进行体内基因转移的一个问题是会产生针对腺病毒衣壳蛋白上抗原表位的抗体。当腺病毒施用于人体时，形成了针对六邻体蛋白的中和抗体，该抗体主要靶向显性HVR区。也已知该抗体通过抑制宿主细胞感染而降低病毒复制效率(Wohlfart，C. (1988)J. Virol. 62，2321-2328 ；Toogood, C. I. A.等人，(1992) J. Gen. Virol. 73，1429-1435 ；Sumida, S. M.等人，(2005) J. Immunol. 174，7179-7185)。当使用病毒基因递送载体和病毒治疗剂而施用腺病毒时，必须解决由针对人HAd5的人中和抗体占多数导致的问题。除了上述与中和抗体相关的问题，也有报道说当全身接触时腺病毒感染肝脏。在这方面，有报道说腺病毒具有嗜肝性，当通过静脉途径施用腺病毒时，24小时内其90%转移至肝脏中(Worgall1S.等人，(1997)人类基因治疗(Hum. GeneTher. )8, 37-44)。由于腺病毒的这种肝选择性，1999年年轻患者Jessie Gelsinger在施用腺病毒基因治疗剂的临床试验中发生了急性肝中毒。此后，腺病毒剂量一直被限制在不超过1Χ1013νρ。因此，通常肝中毒被认为是使用腺病毒的许多基因治疗剂进行非临床/临床试验的剂量限制因素(Alemany，R.等人(2001)基因治疗(Gene Ther.)，8 (17)，1347-1353 ；Christ, Μ·等人，(2000)人类基因治疗(Hum. Gene Ther.), Π (3), 415-427 ；Lieber, A.等人，(1997) J. Virol. ,7(11), 8798-8807) 0这种肝选择性是腺病毒治疗剂进行系统用药时实现有效治愈的主要问题(Worgall，S.等人，(1997) 人类基因治疗(Hum. GeneTher.)，8，37-44)。在这方面，Waddington等人近期报道，Gla域、凝血因子在血液中结合腺病毒六邻体蛋白，其促进了腺病毒转移至肝脏(Waddington, S. N.等人，(2008)细胞(Cell)，132，397-409)。据推测六邻体的HVR-3、HVR_5或HVR-7可与凝血因子、Gla域结合(Kalyuzhniy, O.等人，(2008) Proc. Nat，I Acd. Sci. 105，5483-5488)。HVR 根据腺病毒的血清型而变化，目前还不清楚对于凝血因子的结合亲和力的关键因素是什么。据报道，通过插入特定的蛋白如RGD、RFP和BAP(生物素受体肽)以大大消弱对于凝血因子的结合亲和力从而降低嗜肝性，腺病毒的最大耐受剂量可提高10倍(Shashkova，E. V.等人，(2009)Mol.Ther.17，2121-2130)。目前已知了六邻体蛋白的许多功能，当前进行了许多修饰六邻体蛋白的研究，以克服肝中毒和抗腺病毒免疫力的问题。有4种修饰六邻体蛋白的策略1)用其他腺病毒血清型的对应六邻体基因代替所述六邻体基因，2)将肽插入至HVR中，3)用编码其他腺病毒血清型HVR的对应基因代替编码六邻体蛋白HVR的基因，以及4)将结合凝血因子与中和抗体的区域从HVR中去除。至今，对六邻体修饰使用的是将肽插入至HVR中的方法，以及用编码其他腺病毒血清型HVR的对应基因代替编码HVR的基因的方法。在上述4种策略中，完全的六邻体置换是改变病毒免疫原性的最显而易见的方法。然而，由于结合六邻体与五邻体和纤毛的微小结构差异会导致腺病毒衣壳结构不稳定，因此将完全的六邻体替换为修饰的六邻体蛋白的方法所带来的问题是产能退化(Roberts，D. M.等人，(2006)自然(Nature), 441，p239-243;Youil, R.等人，(2002)人类基因治疗(Hum. GeneTher.) 13，p311-320; Shashkova, Ε·等人，(2009) Mol. Ther. 17,2121-2130)。而且，使用异源腺病毒和人腺病毒血清型对衣壳蛋白的修饰也在深入的研究中。据报道，针对黑猩猩腺病毒pan 5、6、7和9(分别划分为猿腺病毒血清型22至25)的中和抗体的发生率小于6%，因此，包括黑猩猩腺病毒的猿腺病毒载体系统可用作基因治疗载体(Roy’S.等人(2004)人类基因治疗(Hum. Gene Ther.) 15，p519_530)。国际专利申请No. WO2006/040330 和 No. WO 2002/083902 教导了使用人血清型 11、24、26、30、34、3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.分离自具有如SEQID NO: 16所示氨基酸序列的猿腺病毒血清型19的六邻体。2.编码如权利要求I所述六邻体的DNA。3.如权利要求2所述的DNA，其具有如SEQID NO:3所示的核苷酸序列。4.具有如SEQID N0:21所示氨基酸序列的高变区(HVR)，其分离自猿腺病毒血清型19。5.编码如权利要求4所述HVR的DNA。6.如权利要求5所述的DNA，其具有如SEQID NO:20所示核苷酸序列。7.嵌合型腺病毒，其通过在六邻体中用具有如SEQID NO: 16所示氨基酸序列的六邻体蛋白或七(7)个或以上其中的连续的残基进行替换而具有非天然氨基酸序列。8.如权利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述非天然氨基酸序列为具有如SEQIDNO:21所示氨基酸序列的HVR。9.如权利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述非天然氨基酸序列为选自下组的HVR片段SEQ ID NO:21的氨基酸残基11-41 ;SEQ ID NO:21的氨基酸残基46-52 ;SEQ IDNO:21的氨基酸残基69-78 ;SEQ ID NO:21的氨基酸残基106-119 ;SEQ ID NO:21的氨基酸残基126-138 ；SEQ ID NO:21的氨基酸残基160-173 ;以及SEQ ID NO:21的氨基酸残基275-303。10.如权利要求7所述的嵌合型腺病毒，其为人腺病毒。11.如权利要求10所述的嵌合型腺病毒，其中所述人腺病毒选自下组人腺病毒血清型 2、3、5、11、24、26、30、34、35、36、41、48、49 和 50。12.如权利要求7所述的嵌合型腺病毒，其中所述嵌合型腺病毒还包括治疗性转基因。13.如权利要求12所述的嵌合型腺病毒，其中所述治疗性转基因选自下组肿瘤抑制基因、抗原基因、细胞毒素基因、细胞抑制基因、自杀基因、抗血管生成基因和免疫调节基因。14.如权利要求13所述的嵌合型腺病毒，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：李圭铉，尹成泰，高垡经，李洪圭，赵义哲，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：
国别省市：
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