本发明专利技术涉及一种生产自然杀伤细胞(下文中，简称“NK细胞”)的方法、由该方法生产的NK细胞以及包含该NK细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物。本发明专利技术提供一种生产NK细胞的方法，该NK细胞保持高细胞活性和细胞毒性而对癌症和感染性疾病展现高疗效，并且能够以高效率和高浓度在活体外培养。此外，将一种保持细胞浓度处于恒定水平的培养方法用于生产NK细胞，从而可防止细胞的过度生长，这样可使细胞保持在最佳状态。特别地，即使当细胞被冷冻之后解冻时，细胞的功能也不会受损，并且NK细胞可保持高细胞活性和细胞毒性。因此，能够以液体状态或冷冻状态容易地存储和提供NK细胞，而无需额外的处理过程。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及一种生产自然杀伤细胞(下文中，简称“NK细胞”)的方法、由该方法生产的NK细胞以及包含该NK细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物。本专利技术提供一种生产NK细胞的方法，该NK细胞保持高细胞活性和细胞毒性而对癌症和感染性疾病展现高疗效，并且能够以高效率和高浓度在活体外培养。此外，将一种保持细胞浓度处于恒定水平的培养方法用于生产NK细胞，从而可防止细胞的过度生长，这样可使细胞保持在最佳状态。特别地，即使当细胞被冷冻之后解冻时，细胞的功能也不会受损，并且NK细胞可保持高细胞活性和细胞毒性。因此，能够以液体状态或冷冻状态容易地存储和提供NK细胞，而无需额外的处理过程。【专利说明】生产自然杀伤细胞的方法、由该方法生产的自然杀伤细胞 以及包含该自然杀伤细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的 组合物
本专利技术涉及一种生产自然杀伤细胞（在下文中简称为"NK细胞"）的方法、由该方 法生产的NK细胞以及包含该NK细胞的用于治疗癌症和感染性疾病的组合物。
技术介绍
针对癌症治疗，已开发并采用了包括手术、放疗和化疗的多种治疗方法。然而，在 特定的癌症和患者的情况下，难以应用这些治疗方法而且复发的可能性很大。 因此，利用患者的免疫功能的免疫疗法日益受到关注，该免疫疗法基于通过具有 各种功能的免疫细胞之间的复杂的相互作用来去除肿瘤。直接去除癌细胞的免疫细胞包括 NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL)，将抗原呈递至这些效应细胞的免疫细胞包括树突细 胞（DC)或B细胞。其他实例包括分泌各种细胞因子的辅助性T细胞（Th细胞）、调节性T 细胞（Treg细胞）等。在这些免疫细胞中，NK细胞被认为是最快速起效且高效的免疫细胞。 NK细胞是占血细胞的约10%的淋巴细胞且在免疫应答中起重要作用。NK细胞具 有多种功能，特别是具有杀死癌细胞或感染了外部病原菌的细胞的能力，因此NK细胞的功 能是去除癌细胞或去除将发展成癌症的细胞。 大多数NK细胞在机体中通常以灭活状态存在，但是为了将NK细胞用于治疗目的， 需要活化NK细胞。因此，已积极进行了各种研究来活化来自患者的正常血液或灭活血液的 NK细胞。 通过在活体外活化NK细胞获得的NK细胞的高细胞毒性表明了将NK细胞用于免 疫细胞疗法的可能性。据报道，在异基因骨髓移植之后施用在活体外活化的NK细胞时，对 多种癌症具有治疗作用，特别是诸如白血病的血癌（Blood Cells Molecules&Disease，33 :p261-266, 2004)。然而，临床上尚未证明NK细胞对除了血癌以外的实体癌的明显治疗效 果。具体地，据报道，在癌形成之前施用NK细胞可干扰癌植入（Cancer Immunol. Immunoth er.，56(11) :pl733-1742, 2007)，但是这种治疗模式似乎并不合适。此外，据报道，在动物试 验中腹腔注射NK细胞抑制乳腺细胞的生长，但尚不清楚该抑制效果是否可归因于NK细胞 (Breast Cancer Res. Treatment, 104(3):p267-275, 2007)〇 同时，尽管NK细胞可能作为癌症或感染性疾病的治疗剂，但是体内存在的NK细胞 数量并不多，因而需要一种生产大量的NK细胞同时保持足以用于治疗目的疗效的技术。然 而，NK细胞在体外不能被充分培养和扩增。因此，能在有用的水平上培养和扩增NK细胞的 技术已受到关注，但是研究结果尚不能在临床上应用。 不仅利用用于T细胞增殖/活性的IL-2，而且利用IL_15(J. Immunol.，167(6):p3129-3138, 2001 ;Blood，106(1):pl58-166, 2005,KR2009-0121694 A)、刺激 CD3 的 0KT-3 抗体（Experimental Hematol.，29(1) :pl04-l 13, 2001)和1^5(工 Immunol.，165 (1) :pl39-147, 2000)对NK细胞的培养已进行了各种研究。然而，这些研究仅 仅发现了对IL-2应用的修饰以及新型增殖物，并未提出用于增殖的具有划时代意义的方 法。众所周知，当使用IL-2或其他细胞因子或化学物质来培养NK细胞时，NK细胞的数量 比NK细胞的初始数量仅增加了约3-10倍。 -些研究人员报道，使用癌细胞系作为饲养细胞来扩增NK细 胞。据报道，使用白血病细胞系CTV-1在增殖方面显示出改善很小或没有改善 (J. Immunol.，178 (1) : p85-94, 2007)，而使用EBV-LCL培养21天后，细胞数量增加了平均约 490 倍（Cytotherapy, 11 (3) :p341-355, 2009)。此外，使用通过在 K562 细胞中表达 4-1BBL 和膜结合的IL-15所获得的人工APC(抗原呈递细胞）培养NK细胞3周后，NK细胞数量 增加了平均227倍，并在体外和体内呈现高细胞毒性，但是显示出由细胞死亡导致的有限 的增殖（Cancer Res. ,69(9) :p4010-4017, 2009)。最近有报道称，在用 MICA、4-1BBL 和 IL-15转染的K562细胞系中培养NK细胞3周后，NK细胞数量增加了平均350倍（Tissue Antigens, 76 (6) :p467-475, 2010)，并且有报道称，当使用用膜结合的IL-21转染的K562细 胞系培养NK细胞2周同时每隔7天刺激NK细胞时，NK细胞数量增加了平均21，000倍。然 而，由于使用了所有癌细胞系，因此采用了不适合保证对临床应用非常重要的安全性的方 法。此外，由于使用特定的癌细胞作为饲养细胞，因此生产的NK细胞对特定的癌细胞具有 启动特异性。 通过从未分离NK细胞的外周血白细胞（PBL)富集NK细胞而获得的细胞相比于纯 NK细胞具有低细胞毒性，并且包含被自体MHC分子识别自身细胞和非自身细胞的T细胞。 因此，只要未除去T细胞，这些细胞就仅限于自体移植。最近，开发了一种包括NK细胞分 离步骤并利用饲养细胞进行适当刺激来扩增所分离的NK细胞的方法，以及一种利用全PBL 或外周血单核细胞（PBMC)选择性扩增NK细胞的方法。此外，报道了一种培养NK细胞的方 法，所述方法包括在有外周血白细胞存在的情况下，使用包含抗-CD3抗体和白细胞介素蛋 白的培养基来培养NK细胞的过程（KR 10-2010-0011586 A)。 一般的应用于异基因的细胞扩增过程开始于两个连续的步骤：磁性去除CD3+T细 胞和富集⑶56+NK细胞。为了刺激NK细胞增殖，通常使用被照射的诸如PBMC 、Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞样细胞系（EBV-LCL) 这样的饲养细胞。被照射的饲养细胞通过体液因子和直接 的细胞间接触来刺激NK细胞。 在本专利技术中，建立了一种大规模扩增和活化来自健康志愿者的用于临床的NK 细胞的简单而有效的方法。在单步磁性去除CD3+T细胞之后，在0KT3和IL-2存在的情 况下，用被照射的自体PBMC重复刺激并扩增去除的PBMC，得到异基因所需的高纯度的 CD3-CD16+CD56+NK 细本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产NK细胞的方法，包括以下步骤：(i)从人外周血分离外周血白细胞和NK细胞；(ii)在含抗‑CD3抗体、细胞因子和饲养细胞的培养基中静止培养NK细胞，以通过细胞间接触来刺激；(iii)完成步骤(ii)中的静止培养之后，通过加入细胞因子、抗‑CD3抗体和饲养细胞重复刺激细胞，并进行静止培养以刺激，引起细胞间接触；(iv)完成静止培养之后，向细胞中加入含静止培养或悬浮培养所需的细胞因子和类似物的培养基，在保持细胞浓度和细胞因子浓度处于恒定水平的同时，进行静止培养或悬浮培养。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：闵普庆，崔哈娜，林玉宰，许正贤，姜常美，李恩京，郑惠真，黄琉炅，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，GC细胞治疗，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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