一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法技术

本发明专利技术提供一种人类自然杀伤细胞的体外增殖方法，其从健康人类个体的周边血液单核细胞(PBMCs)中培养自然杀伤细胞，并且使自然杀伤细胞经本发明专利技术方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，而且还能保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供一种人类自然杀伤细胞的增殖方法，使自然杀伤细胞经本专利技术方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，并保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。
技术介绍
根据资料，癌症一直高居中国台湾十大死因的第一位，癌症影响层面之广及所耗费社会成本之巨可见一斑。目前为止人类所熟知的抗癌疗法至少有五大类，包括手术切除法、化学治疗及放射线治疗等三种及其合并疗法与民俗疗法。手术疗法虽然效果很好，但有些肿瘤无法以外科手术切除，且手术的后仍会有残存的癌细胞容易造成复发或转移，这正是癌症之所以可怕以及致人于死的主要原因。而已转移或无法以外科手术切除的癌细胞就必须以放射线疗法或化学疗法来治疗，甚至无法以现有的医疗方式达到治疗效果。可是放射线疗法或化学疗法并没有专一性，会将好的细胞以及坏的细胞同时杀死，导致严重的副作用，该副作用对病患本身抗癌能力最为关键的免疫系统的破坏也最严重，这是目前医学上一直无法克服的难题之一，因此这样的治疗无论是在延长寿命或降低副作用方面都仍有大幅改善的空间。因此对于癌症治疗，各界都在积极寻求能抗癌，无副作用而又能加强免疫机能的方法。自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells)是人体内第一道与生俱来的免疫防线(Native immunity)成员之一，也是对抗癌细胞或病毒最强、最有效的细胞。与其它抗癌免疫细胞相比，例如毒杀性T细胞(Cytotoxic T cells)或树突细胞(Dendritic cells)，NK细胞的毒杀性较强、较具广谱性、不受组织兼容性抗原限制(MHC-Restriction) 且不需要致敏作用(I^rimimg)的启动就可直接发动对癌细胞的攻击。除此之外，NK细胞还具有调节免疫能力及和神经系统交互作用的能力。理论上NK细胞可以成为一个有效的癌症治疗手段，然而这种细胞平常在体内的数量本来就不多，只约占血液中白血球的2-6 %， 再加上受到疾病、年龄、压力、不良生活习惯及其它环境因素等的影响，NK细胞的数量及活性常随着年龄增长而逐渐降低，直接或间接促成癌症的发生或恶化；而临床上也常观察到癌症病人的NK细胞数量不足或活性下降的现象。公知技术无法在体外短时间内将NK细胞大量的增殖，且同时保有NK细胞的毒杀活性，再者，公知技术所采用的NK细胞，是取自于已经得到癌症的病患，在这状态下取得的NK细胞对于癌细胞的毒杀能力不够强，即便增殖后再回输于病人体内，所能达到的癌细胞杀伤效果也不高，使得利用NK细胞来治疗癌症的想法固然很有吸引力，但是实际执行上却碍于公知技术的不足而无法真正应用于制备治疗癌症的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于提供，其是可以从冷冻保存的周边血液单核球细胞(Peripheral bloodmononuclear cells, PBMCs)中增殖 CD3—CD56+亚型自然杀伤细胞的方法，使自然杀伤细胞经本方法增殖过后，可达到至少高于增殖前五百倍的细胞数目，并保持自然杀伤细胞的毒杀活性，为人类自然杀伤细胞在用于制备肿瘤疫苗等医疗药物组合时提供一种切实可行的方法。为更好的描述和理解本专利技术，我们将对本专利技术中所涉及的术语做详尽的解释。自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK cells) :NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，分布于周边各淋巴器官及血液循环系统，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒杀效应，并可分泌多种细胞因子及趋化因子。NK细胞的启动NK细胞可表达一系列活化性受体及抑制性受体，两者间的平衡是控制NK细胞是否被启动的重要机制。同时，干扰素及巨噬细胞来源的细胞介素均是NK细胞极强的活化因子。本专利技术中利用重组人类白血球间素(Recombinant human Interleukin, rhIL)、2(rhIL-2)、12(rhIL-12)、15(rhIL-15)、18(rhIL-18)、21(rhIL_21)及其组合的应用来活化NK细胞。NK细胞的增殖是指NK细胞在体外培养中通过一系列的细胞分裂，而达到一定的增殖数目。本专利技术中所增殖的NK细胞主要是⑶3—CD56+亚群的NK细胞。细胞毒杀活性是指由细胞引起的单纯的细胞杀伤事件。NK细胞的毒杀活性不单纯局限于肿瘤细胞，还包括对病毒感染细胞、受损和功能异常细胞的杀伤作用。本专利技术中所涉及的NK细胞毒杀活性主要是指其对肿瘤细胞的杀伤作用。NK细胞毒杀活性的测定目前主要是应用对NK细胞敏感的骨髓白血病(erythroleukemia)细胞株K562和对NK细胞抗性的淋巴肿瘤细胞株Raji为靶细胞，测定NK细胞对它们的杀伤率。本专利技术中应用K562细胞株来测定NK细胞毒杀活性。NK细胞疗法是一种利用高科技的细胞培养技术在短时间内于体外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以对抗癌细胞的NK细胞后，再将其注入病人体内，直接提高病人本身的抗癌能力，达到抗癌、治癌目标的一种医疗技术。NK细胞疗法的前提是NK细胞的启动和大量增殖，并对肿瘤细胞保持高的细胞毒杀伤活性。自体免疫细胞，尤其是NK细胞的免疫细胞治疗法简单的说，是一种利用高科技的细胞培养技术在短时间内于体外(Ex vivo)大量繁殖病人本身可以对抗癌细胞的NK细胞后，再将其注入病人体内，直接提高病人本身的抗癌能力。实际的做法是病人经医师仔细评估且判定适合NK细胞疗法后，从病人身上采集约30毫升的周边血液在符合GTP/GMP规范的无尘、无菌实验室进行连续15天的培养，在过程中以特殊的配方专门培养、增殖其中的NK细胞，使其数量增加达原先的数百倍甚至上千倍后再注入体内，直接提高NK细胞的数量进而达到治疗癌症的目的。利用NK细胞疗法来治疗癌症有下列各种学理上的优势一、NK细胞是人体内抗癌活性最强的细胞，可直接杀死癌细胞抑制肿瘤的生长及扩散；二、NK细胞会抑制肿瘤附近新血管的增生，故可限制肿瘤取得所需要的养份进而限制肿瘤的生长；三、NK细胞可直接改善并调节患者的免疫力及神经系统，间接提高患者的生活质量；四、NK细胞会分泌一种叫做b-endorphin的脑内啡，可减少病患的疼痛令病患有愉悦感，间接提升生活质量 ’五、 副作用低或几乎无副作用。目前一些研究已指出，周边血液自然杀伤细胞所具有的毒杀范围除了包括黑色素瘤、头颈癌之外，还有肺、卵巢、子宫颈、膀胱、前列腺、肝细胞、胰脏、食道、乳房及许多合并的癌症。尤其对肺癌、淋巴癌、食道癌、乳癌、肝癌等血流旺盛且血管较密集地区的癌症较有效。一般的状况下，我们身体以部位计算，会有5到15颗的癌细胞产生，那时，只要一颗NK细胞，就可以杀光这些癌细胞。但是，一但得了癌症，每一颗癌细胞，要250颗当时体内的NK细胞，才能杀死。因此，储存未得癌症前的战斗力高的NK细胞，在万一未来得癌时， 复制成多数以协助抗癌，是目前最有效、无副作用的制备治疗癌症的药物的方法。本专利技术实施例提供，其是一种自冷冻的周边血液单核球细胞中增殖CD3—CD56+亚型自然杀伤细胞，并使增殖后的该自然杀伤细胞数目高于增殖前细胞数目至少五百倍的方法，其中该方法包含以下步骤(a)取得一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一周边血液单核球细胞；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李光辉，
申请(专利权)人：李光辉，
类型：发明
国别省市：