超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用技术

本发明专利技术涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白连接到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人生殖细胞的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)，以及由TAPE法筛选的、具有溶解性和优异的热稳定性的、人或改造的VH和VL结构域抗体和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。还提供了在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。海通了使用该文库筛选的具有靶蛋白质结合能力的VH或VL结构域抗体，包括该结构域抗体的药物组合物。

Screening and modification method of variable domain of super stable immunoglobulin and its application

The present invention relates to a protein called Tat related engineering (TAPE) method, the target protein and antibiotic resistance protein linked to Tat signal sequence and its expression in Escherichia coli, screening target protein has higher solubility and excellent thermal stability, especially the immunoglobulin variable domain from human reproduction cells (VH or VL), as well as people or transformation with solubility and excellent thermal stability screening by TAPE method, VH and VL domains of antibody and human or modified VH and VL domain antibody stent. Libraries of random CDR sequences included in an VH or domain antibody holder, as well as a process for their preparation, are also provided for screening in a TAPE or VL domain antibody holder. Haitong has a VH or VL domain antibody screened with the library for targeting protein binding capability, and a pharmaceutical composition comprising the domain antibody.

【技术实现步骤摘要】
超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用本申请为2012年8月22日递交的申请号为201280076586.9并且专利技术名称为“超稳定免疫球蛋白可变结构域的筛选和改造方法及其应用”的专利技术专利申请的分案申请。
以下公开涉及被称作Tat相关蛋白质改造工程(TAPE)的方法，通过将靶蛋白和抗生素抗性蛋白融合到Tat信号序列并在大肠杆菌内表达它，筛选具有更高的溶解性和优异的热稳定性的靶蛋白，特别是源自人种系的免疫球蛋白可变结构域(VH或VL)。本专利技术还涉及由TAPE法筛选的、具有优异的溶解性和热稳定性的、人重链可变结构域抗体(下文称为“VH结构域抗体”)和轻链可变结构域抗体(下文称为“VL结构域抗体”)和人或改造的VH和VL结构域抗体支架。此外，以下公开内容涉及VH和VL结构域抗体和抗体支架的氨基酸序列，以及编码所述氨基酸序列的多核苷酸。在含有根据本专利技术筛选的人或改造的VH或VL支架的VH或VL结构域抗体具有相应的人或改造的VH或VL结构域抗体支架(不管CDR序列)的情况下，它仍保留溶解性和热稳定性。此外，以下公开内容涉及在由TAPE法筛选的人或改造的VH或VL结构域抗体支架中包括随机CDR序列的文库，以及其制备方法。此外，以下公开内容涉及使用所述文库筛选的、对靶蛋白质具有结合能力的VH或VL结构域抗体，所述结构域抗体的氨基酸序列，编码所述氨基酸序列的多核苷酸。专利技术背景片段化的小尺寸抗体因为它与全长单克隆抗体(mAb)的不同理化性质而是一种能够克服现有抗体疗法的局限性的有前途的抗体。存在单链抗体(scFv)、Fab(片段抗体结合)抗体、免疫球蛋白可变结构域抗体，例如VH或VL等作为一般抗体片段，以及串联scFv、双抗体、微型抗体等作为其修饰形式(Betteretal.,Science1988240(4855):1041-3；Hustonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.198885(16):5879-83；Birdetal.,Science1988242(4877):423-6；Peietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.199794(18):9637-42；Iliadesetal.,FEBSLett.1997409(3):437-41；Wardetal.,Nature1989341(6242):544-6)。抗体片段或小尺寸的抗体与全长单克隆抗体相比主要是丧失了Fc(可结晶片段)的功能，因此，没有由于Fc的存在而产生的预期效果，如，增加的循环半衰期、效应子功能等。然而，小尺寸的片段化抗体被放大作为能够克服由于现有完整抗体的大尺寸造成的局限下一代抗体，所述局限例如对结构上隐藏的表位的可及性、药物渗透和生物分布、形式灵活性、高生产成本等(Zhaoetal.,Blood2007110(7):2569-77；Holligeretal.,Nat.Biotechnol.200523(9):1126-36；Hudsonetal.,Med.Microbiol.Immunol.2009198(3):157-74；Eneveretal.,Curr.Opin.Biotechnol.200920(4):405-11)。此外，各种抗体片段和小尺寸抗体的优点在于可以通过化学方法或重组蛋白融合的方法进行连接来实现双重或多重特异性。近来，这种优点已被用来引入多特异性，使得Fc功能被模块化，从而补充了已被指出作为缺点的效应子功能和短的循环半衰期。例如，将对人血清白蛋白具有结合特异性的片段或小尺寸抗体引入模块中以实现双特异性抗体，从而提高了循环半衰期，或将对免疫细胞，如自然杀伤或T细胞具有特异亲合力的小尺寸抗体引入模块中，从而赋予它细胞杀伤功能(Elsetal.,JBiolChem.20019；276(10):7346-50；Bargouetal.,Science2008321(5891):974-7；etal.,Mol.CancerTher.20087(8):2288-97)。另外，由于单个抗体可以被设计成向预期具有不同作用模式的两个或更多个分子靶标赋予特异性，开启了显著改善抗体的效力和经济可行性的可能性。人抗体结构中具有抗原特异性结合功能的最小单元是重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)，这是定位在轻链或重链N-末端的可变结构域。由于各自两个N-末端已进化成具有互补结构，在从血浆B细胞生产单克隆抗体时组装重链和轻链过程中，VH和VL构成非共价结合型复合体，从而保持其结构的稳定性。人抗体可变结构域VH节段根据在框架部分的氨基酸序列的同源性被分为7个家族(VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7)，但不包括CDR(互补决定区)结合表位，每个家族中含有3至22种不同的氨基酸序列。轻链的VL分为Vκ和Vλ，Vκ分为六个家族而Vλ分为10个家族(Chothiaetal.,1992J.Mol.Biol.227,799-917；Tomlinsonetal.,1995EMBOJ.14,4628-4638；Williamsetal.,J.Mol.Biol.264,220-232)。人们已经知道，一些VH和VL根据相互亲和力的程度而具有优选的VH/VL配对组合，并且因此，已经知晓基因的这种组合重排在扩大抗体库的多样性中起重要作用(Ruudetal.,J.Mol.Biol.1999,285,895-901)。根据6个CDR的组合，结合型的VH/VL向特定抗原赋予互补结合特异性。轻链的CDR1、CDR2和CDR3和重链的CDR1、CDR2和CDR3，共有6个CDR，参与抗原的结合。根据人类种系序列的分析，发现各种各自的CDR大多依赖于重链可变结构域的CDR3。因此，这一分析表明抗体的结合特异性主要取决于重链的CDR3的可变性(J.Mol.Recogni.2000,13,167-187)。与此不同，动物如骆驼和美洲驼以及具有软骨骨架的鱼如鲨鱼具有单重链结构而没有轻链结构的抗体。因此，这些抗体的可变结构域仅包括单个重链可变结构域(对于骆驼和鲨鱼分别是VHH和VNAR)，并且公知的是这种抗体在抗原结合和中和功能方面不比VH和VL同时参与抗原结合的人抗体差。除了在具有重链疾病的人类患者中，VH或VL单独很少存在(Hendershotetal.,J.Cell.Biol.1987104(3):761-7；Prellietal.,J.Immunol.1992148(3):949-52)。其原因是VH或VL在VH或VL单独分离时由于其结构互补体而在结构上是不稳定的，并且因此，可能容易发生蛋白质聚集。已知的是这种蛋白质聚集部分地是由主要在VH和VL界面处分布的疏水性氨基酸残基所造成的疏水性相互作用而引起。不同于人抗体，在骆驼抗体的情况下，具有亲水性的氨基酸残基可以特别地定位在VH/VL边界区域的表面上。具体地，在骆驼抗体的四个位点处的氨基酸(它们是特异地与人VH3家族的那些不同的)被称为四分体。这些氨基酸位于Kabat编号系统的位置37、44、45和47处(Kabatetal.,1991J.Immunol.147(5),1709-1719)。在氨基酸序列中这种差异可以解释单可变结构域抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可溶性VH结构域抗体支架，具有下面的FR1至FR4的氨基酸序列：(1)FR1：X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19在FR1的氨基酸序列中，X0是E或Q，X1是V或L，X2是E，或Q，X3是S，或A，X4是G，或A，X5是G，M，N，V，或E，X6是L，V，或W，X7是V，K，A，或I，X8是Q，K，或H，X9是G，T，A，R，E，S，或T，X10是L，V，R，或M，X11是R，或K，X12是L，I，或V，X13是S，A，或T，X14是A，E，V，R，I，K，T，或S，X15是A，G，P，V，或T，X16是S，F，或Y，X17是F，Y，R，G，或L，X18是T，A，S，N，T，P，I，N，H，或A，X19是F，L，V，或C；(2)FR2：WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28在FR2的氨基酸序列中，X20是V，A，或L，X21是Q，N，R，I，K，Y，V，M，S，Q，W，F，L，V，或C，X22是A，G，K，S，V，M，或T，X23是K，Q，E，R，或T，X24是L，N，I，P，Y，T，V，W，A，R，M，或S，X25是V，或E，X26是W，I，V，P，F，H，M，Y，L，C，或R，X27是V，M，I，或L，X28是S，A，或G；(3)FR3：X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55CX56X57在FR3的氨基酸序列中，X29是R，H，Q，或T，X30是F，V，L，或I，X31是T，S，或I，X32是I，L，V，M，或R，X33是S，T，或D，X34是R，A，V，N，或I，X35是D，N，或A，X36是N，T，D，I，R，K，Y，或E，X37是A，S，V，或T，X38是K，R，T，Q，V，E，M，N，或I，X39是N，R，T，K，S，D，或V，X40是T，M，S，V，I，Y，或A，X41是L，V，A，或M，X42是F，Y，N，D，H，或S，X43是L，或M，X44是Q，E，H，或N，X45是M，L，V，I，或W，X46是N，T，K，D，Y，I，或S，X47是S或N，X48是L或V，X49是R，K，或T，X50是D，A，S，P，T，V，I，或S，X51是E，A，D，或S，X52是T，N，或S，X53是S，A，或G，X54是V，I，L，或M，X55是Y或F，X56是A，G，V，或S，X57是R，S，K，T，L，N，或F；和(4)FR4：X58GX59GX60X61VTVSS在FR4的氨基酸序列中，X58是W，C，Y，G，S，或A，X59是Q，R，或L，X60是A，T，I，或V，X61是L，M，P，V，或T。...

【技术特征摘要】
1.一种可溶性VH结构域抗体支架，具有下面的FR1至FR4的氨基酸序列：(1)FR1：X0VQLX1X2X3GX4X5X6X7X8PGX9SX10X11X12X13CX14X15X16GX17X18X19在FR1的氨基酸序列中，X0是E或Q，X1是V或L，X2是E，或Q，X3是S，或A，X4是G，或A，X5是G，M，N，V，或E，X6是L，V，或W，X7是V，K，A，或I，X8是Q，K，或H，X9是G，T，A，R，E，S，或T，X10是L，V，R，或M，X11是R，或K，X12是L，I，或V，X13是S，A，或T，X14是A，E，V，R，I，K，T，或S，X15是A，G，P，V，或T，X16是S，F，或Y，X17是F，Y，R，G，或L，X18是T，A，S，N，T，P，I，N，H，或A，X19是F，L，V，或C；(2)FR2：WX20RX21X22PGX23GX24X25X26X27X28在FR2的氨基酸序列中，X20是V，A，或L，X21是Q，N，R，I，K，Y，V，M，S，Q，W，F，L，V，或C，X22是A，G，K，S，V，M，或T，X23是K，Q，E，R，或T，X24是L，N，I，P，Y，T，V，W，A，R，M，或S，X25是V，或E，X26是W，I，V，P，F，H，M，Y，L，C，或R，X27是V，M，I，或L，X28是S，A，或G；(3)FR3：X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38X39X40X41X42X43X44X45X46X47X48X49X50X51DX52X53X54YX55CX56X57在FR3的氨基酸序列中，X29是R，H，Q，或T，X30是F，V，L，或I，X31是T，S，或I，X32是I，L，V，M，或R，X33是S，T，或D，X34是R，A，V，N，或I，X35是D，N，或A，X36是N，T，D，I，R，K，Y，或E，X37是A，S，V，或T，X38是K，R，T，Q，V，E，M，N，或I，X39是N，R，T，K，S，D，或V，X40是T，M，S，V，I，Y，或A，X41是L，V，A，或M，X42是F，Y，N，D，H，或S，X43是L，或M，X44是Q，E，H，或N，X45是M，L，V，I，或W，X46是N，T，K，D，Y，I，或S，X47是S或N，X48是L或V，X49是R，K，或T，X50是D，A，S，P，T，V，I，或S，X51是E，A，D，或S，X52是T，N，或S，X53是S，A，或G，X54是V，I，L，或M，X55是Y或F，X56是A，G，V，或S，X57是R，S，K，T，L，N，或F；和(4)FR4：X58GX59GX60X61VTVSS在FR4的氨基酸序列中，X58是W，C，Y，G，S，或A，X59是Q，R，或L，X60是A，T，I，或V，X61是L，M，P，V，或T。2.根据权利要求1的VH结构域抗体支架，其中所述FR1至FR4具有下面的氨基酸序列：(1)FR1：X0VQLX1X2SGGX5X6X7X8PGX9SX10RX12SCX14X15SGX17X18X19在FR1的氨基酸序列中，X0是E或Q，X1是V或L，X2是E或Q，X5是G，N，V，或E，X6是L或V，X7是V或K，X8是Q，K或H，X9是G，T，A，R，E，或T，X10是L或V，X12是L或V，X14是A，E，V，I，K，或S，X15是A，G，或V，X17是F，Y，R，G，或L，X18是T，A，S，N，T，P，I，N，H，或A，和X19是F，L，V，或C；(2)FR2：WVRX21X22PGX23GX2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李滢权，金圣根，朴荣燮，南效廷，金董植，朴在燦，尹桦，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国,KR