本发明专利技术提供了一种从转基因水稻中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括步骤：1)将重组人血清白蛋白粗提取物进行阳离子交换层析，得到初级产物I；2)将初级产物I进行阴离子交换层析，得到中级产物II；3)将中级产物II进行疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。该方法成本低，易于操作，并且获得的rHSA达到99％以上的HPLC纯度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种从水稻种子中规模化分离纯化重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。
技术介绍
人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66. 5kD，等电点在4. 7-4. 9之间。它是人体血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60%左右。每升人血含有HSA约40g。HSA除存在于血浆中外，还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。在人的正常生理条件下，HSA具有维持血浆胶体渗透压、营养和促进伤口愈合的作用，而且其作为载体物质，参与诸多疏水性生物分子如激素、生物学活性物质及药物在血液中的运输。因此，HSA是一种重要的医用蛋白质，在临床上主要用于治疗因失血、烧伤、烫伤、整形外科手术及脑损伤引起的低蛋白血症以及肝硬化、肾水肿等。目前，临床上使用的HSA主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，这种制备途径存在以下缺点一方面血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求；另一方面血液自身也可能存在问题，例如可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的HSA存在巨大的担忧。因此，利用DNA 重组技术生产人血清白蛋白成为当务之急。随着现代DNA重组和合成技术的发展，研究人员对重组人血清白蛋白(rHSA)的生产和应用产生了极大的兴趣。迄今为止，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产rHSA，例如利用原核生物如大肠杆菌(Latta，Μ. et al.，Bio/Technology, 5 1309-1314，(1987))、枯草芽孢杆菌(Saunders, C. W. et al, J. Bacteriol. 169 :2917-2925, (1987))，真核生物如酵母(W0 00/44772，EP0683233A2，US 5612196)、动物细胞培养等生产 rHSA。但这些方法因表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。本专利技术人的中国专利申请No. 200510019084公开了一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导rHSA 进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使rHSA能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。所得的rHSA的表达水平至少达到水稻种子重量的 0.3%以上。该方法具有表达量高、成本低的优势，为蛋白药物的生产开辟了一条新途径。利用任何表达体系生产重组蛋白在进入市场之前需要纯化，而纯化工艺的优劣不仅影响产品质量，还影响生产成本，在纯化与加工步骤的成本是整个成本的80-90%，尤其是从水稻种子中纯化重组人血清白蛋白还没有纯化工艺。因此，研究从水稻种子中纯化人血清白蛋白的简单纯化工艺和工艺流程，具有很大的技术难度和风险。目前，国际上还没有从转基因水稻种子中提取rHSA的工艺，尽管有从酵母和植物悬浮细胞提取重组人血清白蛋白的技术，例如中国专利申请CN101768206A公开了一种毕赤酵母表达的rHSA的纯化方法，包括rHSA的发酵液经陶瓷膜处理，依次经过阳离子交换层析、疏水层析和弱阴离子交换层析，得到纯化的rHSA。然而，由于种子的杂蛋白与酵母和植物悬浮细胞存在很大差别，这些技术不能直接用于水稻种子的rHSA的分离与纯化，因此有必要研究和开发一种简单、高效地从水稻种子中分离纯化rHSA的工艺与流程，获得较高得率、高纯度的rHSA，为工业化生产提供基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种规模化的从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白 (rHSA)的方法。为了实现上述目的，本专利技术提供以下技术方案，依次包括步骤1)将重组人血清白蛋白粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物I ；2)将初级产物I经阴离子交换层析，得到中级产物II ；3)将中级产物II经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。步骤1)中，阳离子交换层析的填料可以选自UNO Sphere S,Nuvia S.Capto MMC, MacroPr印-CM等强阳离子层析树脂。优选使用UNO Sphere S。阳离子交换层析可以采用 PH梯度洗脱或者氯化钠浓度梯度洗脱，优选pH梯度洗脱。在一种实施方式中，阳离子交换层析的洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液，0. 25M氯化钠，pH5. 2。步骤2)中，阴离子交换层析的填料可以选自UNOsphere Q、Q Sepharose FF和DEAE sepharose FF等强阴离子层析树脂。优选使用Q Sepharose FF。在一种实施方式中，阴离子交换层析的洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0. 2M氯化钠，pH7. 5。步骤3)中，疏水层析的填料可以选自Phenyl sepharose HP、Phenyl sepharoseFF、macro_prep t-butyl 禾口 macro-prep methyl 等。优选使用 Phenyl sepharose HP。经疏水层析获得的目标洗脱组分可用已知的方法，例如超滤浓缩、冷冻干燥等方法制成成品。在阳离子交换层析中，使用的上样缓冲液包括醋酸盐缓冲液，其pH小于5. O。阳离子交换层析中使用的目标物(即重组人血清白蛋白)的洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液和氯化钠，或者磷酸盐缓冲液和氯化钠；缓冲液的pH为5. 0 pH6. 7。优选的氯化钠的浓度为0. 25M，缓冲液的pH为5. 2。在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为UNO Sphere S时，使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0. 25M氯化钠，pH5. 2。在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为nuvia S时，洗脱缓冲液包括醋酸盐缓冲液、0. 25M氯化钠，pH5. 0。在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为Capto MMC时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、IM氯化钠，pH4. 7 ；洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液， IM氯化钠，pH6. 7。在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为MacroPrep-CM时，洗脱杂质使用的缓冲液包括醋酸盐缓冲液、IM氯化钠，pH4. 7 ；洗脱目标物使用的磷酸盐缓冲液，0. IM氯化钠，pH6. 5。在一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为Q Sepharose FF时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0. 25M氯化钠。在一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为DEAE sepharose FF时，洗脱杂质使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0. IM氯化钠，洗脱目标物使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0. 25M氯化钠。在疏水层析中，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为 0. IM IM0在一种实施方式中，当疏水层析的填料为Wienyl s印harose HP时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0. 4M。在一种实施方式中，当疏水层析的填料为Wienyl s印harose FF时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0. 1M。在一种实施方式中，当疏水层析的填料为MacroPr印-t-Butyl时，待纯化的含有重组人血清白蛋白的样品中硫酸铵的浓度为0. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，何洋，李光飞，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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