利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法及应用，首先是水稻特异性启动子及信号肽的获得；其次是水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建；第三是使用水稻偏爱密码子合成作为融合载体的水稻非储藏蛋白Ｂｉｐ基因Ｃ－末端和小麦ＰＤ１基因Ｃ末端以及类胰岛素生长因子－１基因；第四是表达融合蛋白载体的构建。第五是获得融合蛋白表达量达到０．３％以上种子干重的转基因水稻和大麦植株。本发明专利技术方法简单，操作方便，成本低廉，此发明专利技术可应用于在谷物胚乳中表达各种多肽。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种利用谷物非储藏蛋白为融合载体在胚乳表达多肽的方法，它包括下列步骤：Ａ、水稻特异性启动子及信号肽的获得：采用水稻储藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的Ｇｔ１３ａ基因的启动子，为了获得Ｇｔ１３ａ启动子和它的信号肽序列，根据基因数据库的Ｇｔ１３ａ合成了一对核苷酸引物用于ＰＣＲ扩增，为了基因克隆，在正向引物的５’端加入了一个粘性末端的内切酶位点，在反向引物的５’端加了另一个平末端的内切酶位点，从水稻品种台北３０９叶片中提取基因组ＤＮＡ，以此ＤＮＡ为模版，按照ＰＣＲ程序，利用上述引物扩增出了一个１２８４碱基的ＤＮＡ片段；Ｂ、水稻胚乳细胞特异性表达载体的构建：经ＰＣＲ获得Ｇｔ１３ａ启动子和信号肽的序列后，ＰＣＲ产物经粘性末端内切酶与平末端的内切酶消化后，将这个片段与经同样的内切酶消化的ｐＢＩ２２１片段连接，然后导入大肠杆菌品系ＤＨ１０Ｂ，形成了含有Ｇｔ１３ａ启动子、Ｇｔ１３ａ信号肽和Ｎｏｓ终止子的水稻胚乳特异性表达的载体，这个载体质粒为ｐＯｓＰＭＰ２；Ｃ、融合蛋白和目的基因的密码子优化：从基因库里获得水稻遗传密码子的水稻Ｂｉｐ基因Ｃ－末端、小麦ＰＤＩ基因Ｃ末端和目的基因类胰岛素生长因子的氨基酸序列，使用水稻偏爱的遗传密码子，由ＤＮＡ分析软件马克载体将基因的氨基酸序列转换成含有优化的水稻遗传密码子的核苷酸序列，在基因合成时，在５’和３’末端分别加上限制性内切酶ＭｙｌＩ和ＸｈｏＩ，便于基因克隆；Ｄ、表达融合蛋白载体的构建：首先是ｐＯｓＰＭＰ２５的构建，将ｐＯｓＰＭＰ２质粒ＤＮＡ用ＭｓｃＩ和ＸｈｏＩ进行双酶切，然后经ＰＣＲ扩增的密码子的人类胰岛素样生长因子基因片段克隆到ｐＯｓＰＭＰ２载体中，转化Ｅ．ｃｏｌｉ宿主细胞ＤＨ１０Ｂ，产生一个含有ＩＧＦ－１基因的中间质粒ｐＯｓＰＭＰ３，再用限制性内切酶ＮａｅＩ和ＮｃｏＩ消化ｐＯｓＰＭＰ３质粒ＤＮＡ，将ＰＣＲ扩增的ＰＤＩＣ的ＤＮＡ片段克隆到中间质粒载体，形成了水稻特异性表达的融合蛋白表达载体ｐＯｓＰＭＰ２５；其次是ｐＯｓＰＭＰ２６的构建：用限制性内切酶ＮａｅＩ和ＮｃｏＩ消化ｐＯｓＰＭＰ３质粒ＤＮＡ，将ＰＣＲ扩增的ＢｉｐＣＤＮＡ片段克隆到ｐＯｓＰＭＰ３质粒载体，形成了水稻种子特异性表达的融合蛋白表达载体ｐＯｓＰＭＰ２６；第三是选择性标记基因载体的构建：为了使选择性标记基因在水稻愈伤组织内表达，采用水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的启动子介导选择性标记基因在愈伤组织中表达，ａ、合成了一对ＰＣＲ引物，ＳＥ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，谢婷婷，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]