一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法。其包括步骤：在添加了天然油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌，从发酵产物中提取聚酮类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体。该方法在于通过基因工程技术在聚酮类化合物的产生菌中过量表达外源的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白，使之利用廉价的天然油脂为原料，提高聚酮类化合物的发酵产量。该方法未见文献报道。该方法操作简单易行，且利用廉价的天然油脂为聚酮类化合物提供合成前体，成本很低，便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。其包括步骤：在添加了天然油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌，从发酵产物中提取聚酮类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体。该方法在于通过基因工程技术在聚酮类化合物的产生菌中过量表达外源的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白，使之利用廉价的天然油脂为原料，提高聚酮类化合物的发酵产量。该方法未见文献报道。该方法操作简单易行，且利用廉价的天然油脂为聚酮类化合物提供合成前体，成本很低，便于推广应用。【专利说明】-种提高聚鋼类化合物发酵产量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法。
技术介绍
聚丽类化合物是一类重要的次级代谢产物，它是由简单脂肪酸经过类似长链脂肪 酸的合成途径生成的，所得的化合物具有一系列复杂的结构，结构的多样性导致了生物活 性的多样性。在自然界中已发现的天然聚丽物质约有2万种，大多数抗生素和一些其他的 重要药物如抗癌药、免疫抑制剂等均属于该个大家族。作为治疗药用途的该类化合物包括 临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素、洛伐他了、雷帕霉素等重要抗 生素，W及农牧业用的阿弗菌素和莫能星、泰乐菌素等。 许多有生物活性的聚丽类化合物由于其宿主不能进行大规模发酵生产而受到限 巧1|(如海绵和腰鞭毛虫的共生菌)，或由于宿主菌难于培养而产率很低。目前有研究将该些 生物中合成聚丽类化合物的途径转入合适的宿主，W提高目的产物的产率，常用的宿主如 大肠杆菌、链霉菌W及植物等。 但是，生物代谢通路在异源宿主中的复制并非一个简单的技术问题，为了进一步 提高聚丽类化合物的发酵产量，有必要对其进行进一步研究，开发新的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的聚丽类化合物的发酵产量不够高，难W 满足实际应用需求的现状，提供一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法。本专利技术通过基因 工程技术改造放线菌，使之能够利用廉价的原料增加胞内醜基辅酶A的含量，为聚丽类次 级代谢产物的合成提供前体，从而大大提高聚丽类化合物的发酵产量。 本专利技术提供的技术方案之一是；一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法，其包括 步骤；在添加了天然油脂的培养基中培养过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因 工程菌，从发酵产物中提取聚丽类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达醜基辅酶A合 成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达醜基 辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达转化体。 本专利技术中，所述的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因工程菌能够过 表达外源的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白，使所述基因工程菌能够利用廉价的原料增 加胞内己醜辅酶A和丙醜辅酶A的含量，从而丰富聚丽类化合物的直接合成前体，提高聚丽 类化合物的产量。 本专利技术中，所述的提高聚丽类化合物发酵产量的方法还包括所述的基因工程菌的 制备步骤：将表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体转化大肠杆菌，然后 将所得的重组大肠杆菌接合转移放线菌，所得的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白 的重组表达转化体即为所述的基因工程菌。 本专利技术中，所述的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白优选来源于攻瑰抱链霉菌 (Str巧tomyces roseosporus)的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白，其分别由来源于攻瑰 抱链霉菌（Str巧tomyces roseosporus)的化巧和化tF基因编码，所述的攻瑰抱链霉菌 更优选攻瑰抱链霉菌NRRL11379菌株。其中，所述的来源于攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus)的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的氨基酸序列分别优选如SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示。所述的来源于攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus)的Dp1:E 和化tF基因的核巧酸序列分别优选如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。 对于上述氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的醜基辅酶A合 成酶和醜基载体蛋白，本领域技术人员知晓，与其具有一定的同源性(较佳地为同源性大于 85%)的同源蛋白应当能够实现与其相同或基本相同的功能。对于上述核巧酸序列如SEQ ID N03和SEQ ID NO. 4所示的化巧和化tF基因，本领域技术人员知晓，与其具有一定的同源 性(较佳地为同源性大于85%)的同源基因应当能够实现与其相同或基本相同的功能。 本专利技术中，所述的重组表达载体可通过本领域的常规方法获得，即；将编码所述醜 基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因连接于表达载体上构建而成。所述的表达载体为本 领域常规，所述表达载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、瞻菌体或病毒载体等，优选放线菌常 用的各种整合型或复制型载体，所述的整合型载体包括各种瞻菌体整合位点适用的载体， 如pSET152、pS0K804，pSAM2等，所述的复制型载体优选pWhm3等，本专利技术中所述的表达载体 最优选为质粒PSET152,即所述的重组表达载体最优选通过将编码所述醜基辅酶A合成酶 和醜基载体蛋白的基因连接于质粒PSET152构建而成。 其中，在所述的重组表达载体中，启动编码所述醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋 白的基因表达的启动子可W为常规，只要其能启动目标基因表达即可，较佳地，所述的启动 子为红霉素抗性基因启动子erm*E，其编码核巧酸序列如SEQ ID NO. 5所示。 本专利技术中，所述的放线菌为本领域常规所述，只要其存在聚丽类化合物或聚丽 NWS杂合化合物的合成途径，且能满足使所述的重组表达载体稳定地自行复制，使所述重 组表达载体携带的编码醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因能被有效表达即可。其 中较佳地，所述放线菌为游动放线菌（Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus),更优选游动放线菌（Actinoplanes sp. )N902-109(阳RM BP-3832)菌株或 者吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253菌株。将前述重组表达载体转化 至上述菌株中，即可得本专利技术优选的基因工程菌株。 本专利技术中，所述的培养基为本领域常规的适合放线菌生长的培养基。所述的天然 油脂为本领域常规，更佳的是天然植物油脂，优选豆油、玉米油和花生油中的任一种或多 种。 本专利技术中，所述的聚丽类化合物为本领域常规所述，优选雷帕霉素。 本专利技术提供的技术方案之二是；一种生产雷帕霉素的基因工程菌，其为将含有表 达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制 得的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达转化体。 所述的放线菌为本领域常规所述，只要其存在雷帕霉素的合成途径，且能满 足使编码所述的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因被有效表达即可。其中较 佳地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法，其特征在于，其包括步骤：在添加了天然油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌，从发酵产物中提取聚酮类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白重组表达转化体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡海峰，黄鹤，
申请(专利权)人：上海医药工业研究院，中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：上海;31