增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法技术

一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因，来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，来增加盐霉素合成中所需三种前提物质的供应，实现盐霉素产量的提高。本发明专利技术所得到工程菌株盐霉素的发酵终产量提高260％，实验室摇瓶水平达到2g/L。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程技术，特别涉及一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平 的方法。 技术背景 放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60%以上是由放 线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一 直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿 瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生 物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅 酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。 盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌（Streptomycesalbus)产生的。盐霉 素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革 兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同为钠钾离子的螯合载体， 通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为 抗球虫病药物。1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂。自1993年 经我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜 牧业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目 前临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重 要性，本 申请人:的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因 簇，2012年完成了其产生菌白色链霉素DSMZ41398(Str印tomycesalbusDSMZ41398)的全 基因组测序。通过对基因组进行分析，我们发现DSMZ41398中存在着完整的三种前体（丙 二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A)的生物合成途径，但是部分关键酶只 有一个拷贝且不具有特别突出的转录活性，这暗示着菌体内前体物的供应并没有处于很高 的水平，盐霉素的生产能力可能受到前体物供应的制约。 通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类 化合物的最终产量。在天蓝色链霉菌中，通过加倍乙酰辅酶A羧化酶基因可以使放线紫红 素产量提高6倍；在棒状链霉菌CKD1119中，通过加倍甲基丙二酰辅酶A变位酶可以使F靠 06产量提高2倍；然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过加倍前体合成途径 中的限速基因，使得菌体可以产生更多的前体，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。为 此，本专利技术尝试通过分别加倍三个前体合成途径中的限速步骤基因来提高盐霉素的产量， 为盐霉素工业化规模的扩大和生产成本的降低提供有效的参考。
技术实现思路
本专利技术的目的，在于提供一种通过增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方 法。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用了以下技术方案： -种，是通过整合型载体PSET152 在白色链霉素DSMZ41398(Str印tomycesalbusDSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝 色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于 自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高； 所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQIDNO. 1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变 位酶基因的序列如SEQIDNO. 2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQIDNO. 3 所示。 所述加倍的构建步骤如下： 第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整 合型质粒载体I; 第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因 的整合型质粒载体II; 第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整 合型质粒载体III; 第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链 霉素DSMZ41398中进行同源重组； 第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突 变株。 所述的质粒载体I的构建方法是在质粒PIB139的Ndel/EcoRI位点插入来自天蓝 色链霉菌的3. 67kb的乙酰辅酶A羧化酶基因PCR片段Ndel/EcoRI;所述的质粒载体II的 构建方法是在质粒PIB139的Ndel/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的4. 17kb的甲基丙二酰 辅酶A变位酶基因PCR片段Ndel/EcoRI;所述的质粒载体III的构建方法是在质粒pIB139 的Ndel/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的I. 37kb的巴豆酰辅酶A还原酶基因PCR片段 Ndel/EcoRI。 所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33°C、220转/分 钟的转速下培养36?48小时后，转接到种子培养基，于33°C、220转/分钟的转速下培养 16?20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。 所述TSBY培养基含有：TSB3%，酵母提取物0.5%，蔗糖10. 3%;所述种子培养基 含有：葡萄糖4 %，黄豆饼粉3 %，酵母提取物1 %，碳酸钙0. 2 % ;所述发酵培养基含有：胚 芽粉0. 8 %，黄豆饼粉0. 5 %，氯化钾0. 22 %，氯化钠0. 1 %，尿素0. 16 %，酒石酸0. 2 %，硫 酸镁0. 01 %，磷酸氢二钾0. 01 %，碳酸钙0. 5 %，大豆油15 %。 所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3%的接种量转接于种子培养基， 所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10%的接种量转接于发酵培养基。 采用本专利技术的方法，可以增加菌体内总的前体物的供应，进而提高用于盐霉素合 成的前体供应以此来提高盐霉素发酵，最终乙酰辅酶A羧化酶加倍突变株的盐霉素发酵产 量提高幅度最大，达到260 %以上，最终产量达到2. 0g/L，可显著提高盐霉素的发酵产量， 同时使发酵成本大幅降低。 本专利技术所涉及的菌株白色链霉菌DSMZ41398已经在SCI数据库文献《Yurkovich ME,TyrakisPA,HongH,SunY,SamborskyyM,KamiyaK,LeadlayPF:Alate-stage intermediateinsalinomycinbiosynthesisisrevealedbyspecificmutationinthe biosyntheticgenecluster..Chembiochem2012,Jan2 ;13 (I) :66_71》中公开。 本专利技术所涉及的质粒PIB139已经在SCI数据库文献《WilkinsonCJ， Hughes-ThomasZA1MartinCJ,BohmI1MironenkoT1DeaconM1WheatcroftM1Wirtz G,StauntonJ,LeadlayPF. :Increasingtheefficiencyofheterologouspromotersin actinomycetes.JMolMicrobiol本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高；所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1. 一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体PSET152在 白色链霉素 DSMZ41398(Str印tomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色 链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自 身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高； 所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO. 1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位 酶基因的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO. 3 所示。2. 根据权利要求1所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于， 所述加倍的构建步骤如下： 第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整合型 质粒载体I ; 第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的整 合型质粒载体II ; 第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整合型 质粒载体III ; 第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链霉素 DSMZ41398中进行同源重组； 第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突变 株。3. 根据权利要求2所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于， 所述的质粒载体I的构建方法是在质粒PIB139的Ndel/EcoRI位点插入来自天蓝色链霉 菌的3. 67kb的乙酰辅酶A羧化酶基因 PCR片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，芦晨阳，蒋明，康前进，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31