脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术和生物防治领域，特别是涉及具有潮霉素B抗性的脐孢木霉菌（Trichoderma brevicompactum）0248转化株在提高木霉素产量中的应用。本发明专利技术通过获得含潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株，并在液体发酵培养基中加入潮霉素B，从而提高发酵液中木霉素的浓度。该发明专利技术为提高木霉素的发酵单位提供了一种可靠的方法，提供了具有潮霉素B抗性的脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用。

【技术实现步骤摘要】
脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用
本专利技术涉及微生物技术和生物防治领域，特别是涉及具有潮霉素B抗性的脐孢木霉菌(Jrichoderma brevicompacturn) 0248转化株在提高木霉素产量中的应用。
技术介绍
木霉素(trichodermin)-单端孢霉烯类化合物的一种，该化合物对常见9种植物病原真菌的菌丝生长和孢子萌发均有不同程度的抑制作用，对黄瓜立枯病和番茄灰霉病等真菌病害有良好的生防效果，因此被认为是具有广阔生防应用前景的抗真菌物。木霉素主要由木霉属真菌脐孢木霉菌(Z brevicompactum)发療产电。为了提高木霉素的开发价值和市场竞争力，不少研究者采用物理诱变和诱导等方法以期提高木霉素产量，但在现阶段，木霉菌产素水平离工业化进程相距甚远。研究组从大蒜中分离筛选到一株产木霉素的内生真菌-脐孢木霉菌(K bre vi compac turn ) 0248,也一直致力于提高木霉素发酵单位的研究。
技术实现思路
在研究提高脐孢木霉菌0248产素水平的试验中发现，一株具有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化株在含有潮霉素B的培养基中发酵产木霉素的浓度比脐孢木霉菌0248要高。 本专利技术通过获得含潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株，并在液体发酵培养基中加入潮霉素B，从而提高发酵液中木霉素的浓度。该专利技术为提高木霉素的发酵单位提供了一种可靠的方法。 本专利技术的目的是针对野生型菌株脐孢木霉菌0248产素水平低的不足，提供一种提高木霉素产素水平的方法；本专利技术的另一目的是提供了具有潮霉素B抗性的脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用。 本专利技术所述的脐孢木霉菌0248,分类命名为brevicompactum。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏日期2012年12月12日，保藏登记号CGMCC N0.6985。 本专利技术目的通过以下技术方案来实现:1.以PCAMBIA0380质粒为基础，通过限制性内切酶酶切和T4DNA连接酶连接反应，将pSilent-Ι质粒上的潮霉素B抗性基因连接到pCAMBIA0380质粒的T-DNA区形成新的质粒PCAMBIA0380-H 质粒；2.通过热激转化，将pCAMBIA0380-H质粒转化至农杆菌AGL-1中，并提取阳性克隆子中质粒，然后通过PCR验证阳性克隆子是否正确；3.将经PCR验证了的阳性克隆子农杆菌(命名为AP03H)与脐孢木霉菌0248孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素B的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板筛选阳性转化株，获得的阳性转化株(命名为AZl)；4.使用含潮霉素B的液体培养基(培养基组成为:牛肉膏10g/L，葡萄糖8 g/L，NaCl2 g/L，潮霉素B 0.1 g/L )培养AZ1，培养条件为:28 °C, 180 r/min，振荡培养72 h，发酵液经5000r/min离心1min,上清液用于木霉素含量的测定；5.木霉素的检测方法:采用气相色谱法测定，色谱柱HP-5弹性石英毛细管柱(以5 %苯基甲基硅氧烷为固定液，30 mX320 ymX0.25 μ m);检测器:氢火焰离子检测器(FID);检测器温度270V ;进样口温度250 V ;柱温度:程序升温，初始温度100 °C，保持5 min,以10 V /min升温至260 °C保持5 min ;载气:氮气；流速1.5 mL/min。 本专利技术的有益效果:本专利技术获得了含有潮霉素B抗性基因的脐孢木霉菌转化菌株AZ1，该菌株在含潮霉素B的液体培养基中木霉素产量为野生型菌株的6.1倍，显著提高了发酵液中木霉素的浓度，这为木霉素产量的提高提供了一种可靠的方法。 【附图说明】 图1质粒PCAMBIA0380-H构建流程图。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用作进一步描述。 实施例1 (含潮霉素B抗性基因片段质粒的制备)按以下步骤进行: (I)使用LB培养基在37 °C, 180 r/min的条件下培养pSiIent-1及pCAMBIA0380质粒的宿主菌，12 h后采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，分别提取pSilent_l及PCAMBIA0380 质粒。 (2)使用限制性内切酶fciX I和為a I酶，分别对pSilent_l、pCAMBIA0380质粒进行双酶切，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，割取目标条带，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目标条带。 (3)使用T4 DNA连接酶将pSilent_Si质粒上的潮霉素B抗性基因片段(Hygr)连接到pCAMBIA0380质粒的BstX I/Xma I酶切位点，此时的质粒命名为pCAMBIA0380_H。 实施例2 (农杆菌介导转化)按以下步骤进行:Cl)将pCAMBIA0380-H质粒转化农杆菌AGL-1感受态细胞中，在YEB培养基中(培养基组成为:蔗糖5 g/L，酵母提取物I g/L，蛋白胨10 g/L，硫酸镁0.5 g/L) 28°C培养两天后挑取单菌落，并提取质粒，使用潮霉素B抗性基因验证引物H-F/H-R (H-F:GAAGAGGTAAACCCGAAACG, H-R:GGCA AACTGTGA TGGACGAC)进行菌液 PCR，进一步筛选阳性转化子，经验证的农杆菌阳性克隆子命名为AP03H。 (2)将阳性克隆子AP03H菌与脐孢木霉菌0248的孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至0248菌中，通过含潮霉素B (100 μ g/mL)的马铃薯葡萄糖琼脂平板筛选获得阳性转化株(命名为AZl)；(3)使用含潮霉素B的液体培养基(培养基组成为:牛肉膏10 g/L，葡萄糖8 g/L,NaCl2 g/L，潮霉素 B 0.1 g/L ),28 °C，180 r/min，振荡培养 72 h，发酵液经 5000r/min 离心lOmin，气相色谱法分别检测脐孢木霉菌0248和转化菌株AZl中发酵液中木霉素的含量，结果发现AZl菌发酵液中木霉素浓度为680.39mg/L,而脐孢木霉菌0248菌发酵液中木霉素的浓度为111.54mg/L，提高了约6.1倍。本文档来自技高网...

【技术保护点】
脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用，其特征在于首先获得具有潮霉素B抗性基因片段的质粒pCAMBIA0380‑H，将pCAMBIA0380‑H质粒转化农杆菌AGL‑1感受态细胞中，筛选获得农杆菌阳性克隆子（命名为AP03H），将阳性克隆子AP03H与脐孢木霉菌0248的孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素B的平板筛选获得阳性转化株（命名为AZ1）；转化株AZ1在含有潮霉素B的液体培养基中进行发酵。

【技术特征摘要】
1.脐孢木霉菌转化株在提高木霉素产量中的应用，其特征在于首先获得具有潮霉素B抗性基因片段的质粒PCAMBIA0380-H，将pCAMBIA0380_H质粒转化农杆菌AGL-1感受态细胞中，筛选获得农杆菌阳性克隆子(命名为AP03H)，将阳性克隆子AP03H与脐孢木霉菌0248的孢子悬液共同培养，使潮霉素B抗性基因转化并整合至脐孢木霉菌0248中，通过含潮霉素...

【专利技术属性】
技术研发人员：申屠旭萍，袁小枫，俞晓平，刘卫平，汤谷，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33