一种提高ＳＡＭ合成酶表达量的方法技术

本发明专利技术提供了一种大规模制备腺苷蛋氨酸合成酶的方法。该方法通过选择性添加二价金属离子和絮凝剂，可使工程菌在发酵液中的ＳＡＭ表达量提高，同时，可以使发酵液浊度下降从而更利于酶的进一步提取制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种提高SAM合成酶表达量的方法，属于生物制药

技术介绍
中国是人口大国，同时也是“肝炎大国”。据1992年全国病毒性肝炎流行病学调 查，全国约有1. 2亿人携带乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率为3. 1%。我国现 有2000万例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能转化为肝硬化，甚至肝癌。腺苷蛋氨酸(SAM)是人体内一种极为重要的中间代谢产物。它可以通过转硫途 径生成体内关键的抗氧化及解毒物质——半胱氨酸，再生成另一种关键的抗氧化和解毒物 质——谷胱甘肽，解除肝内的氧化物应激状态，从而达到防治肝病的目的。另外SAM还可以 促进依赖性脂磷脂的合成，降低胆固醇和磷脂的比例，恢复细胞膜的流动性，促进胆汁的主 动转运和甘油酸三脂的分泌。因此SAM对肝内胆汁郁积、各种急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝 硬化等肝脏疾病有很好的疗效。SAM于20世纪80年代出现在欧洲医药市场上，1999年美 国FDA正式批准SAM上市，使其迅速成为畅销的营养保健品之一，年销售额超过10亿美元。 由于其疗机理清楚、效显著、起效快、副作用小，近年来在国内的需求量也越来越大，有广阔 的市场前景。目前，SAM的生产方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法3种。化学合成法采用S —腺苷同型半胱氨酸(S-adenosythomocysteine)和甲基供体 (CH3I)合成，腺苷蛋氨酸有⑴和(一)两种构型，只有(一)构型才有生物活性，但合成 产物中含有大量(+)腺昔蛋氨酸，且难以分离。发酵法采用在培养基中添加L-甲硫氨酸，用 酵母发酵生产(一)型腺苷蛋氨酸，是60年代至80年代生产腺普蛋氨酸的主要方法。酶 促转化法主要利用腺苷蛋氨酸合成酶催化底物L 一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔蛋氨 酸。酶作为生物催化剂具有快速、专一的特点，因此酶促转化法生产腺苷蛋氨酸具有高效、 工艺简单、产品生物活性高且无污染的优势。腺苷蛋氨酸合成酶又称腺苷甲硫氨酸合成酶，广泛存在于动、植物和微生物体内， 随后又有人从大肠杆菌和酵母菌中分离腺苷蛋氨酸合成酶并用于腺苷蛋氨酸的制备，但 是腺苷蛋氨酸合成酶在动、植物和微生物体内含量少、酶活性不高，且分离纯化困难，例如 400g酵母干细胞只能分离纯化得到8U腺苷蛋氨酸合成酶，比活力为0. 05U/mg。大肠杆菌 腺苷蛋氨酸合成酶由Mr为43000的4个相同亚基组成，亚基含384个氨基酸残基。酵母的 腺苷蛋氨酸合成酶有2种类型，并分别以二聚体和四聚体的形式存在，这2种类型的酶分别 由2个不连锁的基因-saml和sam2所编码；大鼠腺苷蛋氨酸合成酶在大鼠肝脏、肾脏、脑组 织种都含有，其中在大鼠肝脏内有高分子量和低分子量2种腺苷蛋氨酸合成酶，高分子腺 苷蛋氨酸合成酶Mr为43647，其cDNA克隆与met K有52%同源性。近年来随着基因技术的不断发展，不同生物来源的腺苷蛋氨酸合成酶的编码基因 已有较多报道(张建国，李新华，袁中一.腺苷甲硫氨酸合成酶的基因及结构研究进展.工 业微生物. 2005，35 (3) :39-44)，如大肠杆菌腺苷蛋氨酸合成酶(SAMS)是由met K基因编码，Markham et al最先测定了 met K的DNA序列和酶的氨基酸序列，met K长1152bp， 编码区上游有明显对称的操纵子序列没变吗383个氨基酸，酶的亚基为41941Da。Chiang et al等通过DEAE-纤维素从酿酒酵母中分离得到两种腺苷蛋氨酸合成酶(sams I和sams II)，它们分别以四聚体和二聚体的形式存在；Cherest et al证明着两种酶分别由两个独 立的基因(sam2，saml)编码。Saml位于ETH10，长1149bp，编码382个氨基酸，sams II亚基 为 41800Da ;sam2 位于 ETH2，1152bp，编码 384 个氨基酸，sams I 亚基为 42300Da。Saburo H 从入gtll文库中分离得到大鼠肝脏ΜΑΤΙΑ的cDNA，其编码的亚基为43647Da，大鼠的MATlA 基因是单拷贝，它的转录开始于TATA后29bp处(帽子结构)，启动子位于-1405 _958bp， 序列分析表明这个区域和转录因子HP-I、NF-I、HNF-3符合，_193bp _87bp结合 HNF-4, -518bp 366bp 结合阻遏物，-958bp -727bp 和 _375bp -193bp 结合激活物。 另外，很多其它来源的腺苷蛋氨酸合成酶基因，如微生物中枯草芽孢杆菌的SAMS是metE编 码的400个氨基酸。采用基因工程重组技术获得表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌并将所得工程菌用 于不同菌种中通过发酵表达得到腺苷蛋氨酸合成酶已是现有技术中一种较为成熟的技 术。陶敏等(陶敏，干信.S-腺苷甲硫氨酸合成酶在大肠杆菌中的表达与克隆.生物技术 , 2006,16(3) 20-22)通过克隆与表达大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶的基因，在大 肠杆菌中表达出了具有生物活性的S-腺苷甲硫氨酸合成酶。杨静等(杨静，孙进，等 .酿 酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达.中国药科大学学报 , 2002,33(3) 253-255)通过构建S腺苷甲硫氨酸合成酶基因工程菌，将构建的工程菌 在大肠杆菌中高效表达出了 S-腺苷甲硫氨酸合成酶，为酶促转化法生产S-腺苷甲硫氨酸 奠定了基础。罗赞星等(罗赞星，袁中一，等.S-腺苷甲硫氨酸合成酶反应条件的优化.工 业微生物. 2008，38 (2) 6-10)以带有酿酒酵母基因的甲醇营养型重组毕赤酵母为实验 菌株，通过发酵得到了 SAM合成酶。要将酶促合成法应用于工业化生产，大量获得催化用的腺苷蛋氨酸合成酶成为关 键。而现有技术中，大量获取催化用的腺苷蛋氨酸合成酶的途径是通过基因工程重组技术 获取高效表达腺苷蛋氨酸合成酶工程菌，再将工程菌在不同微生物菌株中发酵表达腺苷蛋 氨酸合成酶。本专利技术采用基因工程重组技术，获得了高效表达腺苷蛋氨酸合成酶的工程菌， 在用工程菌发酵表达腺苷蛋氨酸合成酶的基础上，通过在发酵过程中选择性的加入二价金 属离子，提高了合成酶在工程菌中的表达量，同时在发酵液中加入了絮凝剂，更有利于后期 酶的提取，以更为大规模地制备腺苷蛋氨酸合成酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高SAM合成酶表达量的方法。具体地，本专利技术所述的方法为将重组大肠埃希氏菌CGMCC No. 2299接种到发酵基 础培养基中发酵，其中所述发基础培养基中选择性的加入二价金属离子和絮凝剂。其中重 组大肠埃希氏菌株已于2007年12约26被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2299，该菌种已在中国专利申请CN101392230A中公开记 载。本专利技术中，所加入的二价金属离子为Cu2+、Mg2+或Zn2+中的任意一种，所加入的絮凝剂为磷酸氢二钠和氯化钙。本专利技术中，所加入的二价金属离子的量为0.02 0. 15g/100ml培养基，所加入 的絮凝剂磷酸氢二钠的量为0. 2 0. 5g/100ml培养基，所加入的絮凝剂氯化钙的量为 0. OOlg 0. 005g/100ml 培养基优选地，该发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高ＳＡＭ合成酶表达量的方法，其特征在于将重组大肠埃希氏菌ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２２９９接种到发酵基础培养基中发酵，其中所述发基础培养基中选择性的加入二价金属离子和絮凝剂，所述二价离子为Ｃｕ↑［２＋］、Ｍｇ↑［２＋］或Ｚｎ↑［２＋］中的任意一种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊国裕，吉春，周德胜，
申请(专利权)人：北京凯因科技股份有限公司，北京凯因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]