本发明专利技术涉及基因工程领域中表达载体，具体地说，涉及一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用。高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQID NO.1中碱基序列所示。高效分泌表达异源蛋白的载体，含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6×His标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为T7启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OU01）的壳聚糖酶信号肽。本发明专利技术载体在高效分泌表达外源基因的同时有效地提高表达产物的水溶性，利用亲和层析一步纯化即可以得到具有生物活性的重组蛋白。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及基因工程领域中表达载体，具体地说，涉及一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用。高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQID NO.1中碱基序列所示。高效分泌表达异源蛋白的载体，含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6×His标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为T7启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OU01）的壳聚糖酶信号肽。本专利技术载体在高效分泌表达外源基因的同时有效地提高表达产物的水溶性，利用亲和层析一步纯化即可以得到具有生物活性的重组蛋白。【专利说明】一种高效分泌表达异源蛋白的载体及其应用
本专利技术涉及基因工程领域中表达载体，具体地说，涉及一种高效分泌表达异源蛋 白的载体及其应用。
技术介绍
随着分子生物学技术的发展和大规模测序技术的进步，大量具有重要应用前景的 功能基因被挖掘出来。利用基因工程对功能基因进行重组表达，可以获得具有生物学活性 的功能蛋白。蛋白的体外重组表达系统包括原核表达系统和真核表达系统，以大肠杆菌为 代表的原核表达系统具有操作简单、表达迅速、高效等优点，成为最受关注的表达系统。 在大肠杆菌体外重组表达系统中，包涵体的形成、重组蛋白分离纯化过程中的蛋 白变性和复性等问题严重制约了功能基因产品的规模化制备。分泌表达作为一种重要的表 达方式被广泛采用。分泌表达指重组异源蛋白通过一定的方式(运输或者分泌)定位于细胞 周质，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。重组蛋白的分泌表达一般通过将一段信号肽序列 嵌合到目的基因上游，在基因翻译过程中将表达产物整合到新生肽链的N端序列上，进而 与细菌细胞膜的特异性受体识别并结合，引导生成的目的多肽分泌到细胞外周质空间或发 酵培养基中；在穿膜过程中，信号肽被宿主编码的信号肽酶切除，从而更有利于形成目的蛋 白的天然N-末端。此外，大肠杆菌细胞周质是一个氧化还原的环境，存在一系列的酶，有利 于重组蛋白内-硫键的形成以及增强含有疏基蛋白的正确折置，并减少重组蛋白对宿主菌 的毒性，增加宿主菌的适应性。此外，细胞周质空间和胞外培养基中的宿主蛋白含量很低， 也有利于目的蛋白的分离纯化。目前，制约重组蛋白分泌表达一个重要因素是高效分泌表 达信号肽的欠缺，在前期研究中，人们也陆续发现了包括大肠杆菌外膜蛋白信号肽ompA在 内的许多可以实现异源蛋白分泌表达的信号肽，但是在实际应用中，其分泌表达效率较低， 导致规模化制备分泌表达蛋白的得率低，目的蛋白的生产成本高。因此，寻找更为高效的信 号肽对于分泌表达蛋白的规模化制备具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有分泌表达载体所用的信号肽分泌效率低的不足，提供 一种高效分泌表达异源蛋白的信号肽，以及含有该信号肽的重组表达载体及其应用。 为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为： -种高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽，高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽 为SEQIDNO. 1中碱基序列所示。 高效分泌表达异源蛋白的载体，含有一条特定的核苷酸序列，该序列为启动子和 编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编码信号肽的核苷酸序列、6XHis标 签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为17启动子，编码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp.OUOl)的壳聚糖酶信号肽。所述载体带有PmaCI的单酶切位点，所述复制起点为pUC。所 述载体的受体菌的复制原点及高拷贝复制原点为florigin和pUCorigin。 高效分泌表达异源蛋白载体的构建方法， 1)以CHISP-F/CHISP-R为引物对，Microbacteriumsp. 0U01 的基因组DNA为模板， 扩增所得产物如SEQIDNO. 1中碱基序列所示，PCR产物再经限制性内切酶NdeI和EcoR I进行双酶切，回收含有双酶切位点的片段； 【权利要求】1. 一种高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽，其特征在于：高效分泌表达异源蛋白的 编码信号肽为SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。2. -种权利要求1所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：含有一条特定 的核苷酸序列，该序列为启动子和编码信号肽的核苷酸序列；结构图示为：启动子序列、编 码信号肽的核苷酸序列、6XHis标签序列和PmaCI酶切位点；所述启动子为17启动子，编 码信号肽为微杆菌（Microbacterium sp. 0U01)的壳聚糖酶信号肽。3. 按权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：所述载体带有 PmaCI的单酶切位点，所述复制起点为pUC。4. 按权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白的载体，其特征在于：所述载体的受体 菌的复制原点及高拷贝复制原点为florigin和pUC origin。5. -种权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白载体的构建方法，其特征在于： 1) 以 CHISP-F/CHISP-R 为引物对，Microbacterium sp. OUOl 的基因组 DNA 为模板，扩 增所得产物如SEQ ID NO. 1中碱基序列所示，PCR产物再经限制性内切酶Nde I和EcoR I 进行双酶切，回收含有双酶切位点的片段；2) 以MIH/pCR T7/NT T0P0 T质粒为基础质粒，利用限制性内切酶NdeI和EcoR I进行 双酶切，回收大片段；将回收的片段与步骤1)回收的含有双酶切位点的片段利用T4DNA连 接酶连接后进行转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，筛选得到阳性克隆含有的高效分泌表达 异源蛋白重组载体，即为PCT7-CHISP6H。6. -种权利要求2所述的高效分泌表达异源蛋白载体的应用，其特征在于：所述载体 在微杆菌(Microbacterium sp. 0U01)与芽孢杆菌（Bacillus sp. S-I)的壳聚糖酶成熟肽分 泌表达中的应用。【文档编号】C12N15/66GK104342445SQ201310314724【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月24日 优先权日:2013年7月24日 【专利技术者】张继泉, 孙玉英, 相建海 申请人:中国科学院海洋研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽，其特征在于：高效分泌表达异源蛋白的编码信号肽为SEQ ID NO.1中碱基序列所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张继泉，孙玉英，相建海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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