基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本发明专利技术提供的基因在作为短链醇耐受靶点上的应用中的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。本发明专利技术发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。将微生物中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇中的耐受性。

【技术实现步骤摘要】
基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法
本专利技术属于基因工程
，特别涉及基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。
技术介绍
随着全球石油供求关系的日益紧张，燃料乙醇作为清洁、可再生能源正在成为新的燃料替代品。第一代燃料乙醇技术是以含糖质和淀粉质作物作为原料生产乙醇，因为该第一代燃料乙醇技术所使用的原料需要用到糖质或淀粉质的农作物，所以存在与人争粮的问题。第二代燃料乙醇技术是以世界上最丰富的可再生资源木质纤维素为原料生产乙醇，其有效地避免了燃料乙醇生产与人争粮的问题。木质纤维素原料经预处理后主要生成葡萄糖和木糖两大单糖，而大多数的乙醇生产菌株如酵母、运动发酵单胞菌等都不能天然利用木糖，那么如何利用微生物快速发酵葡萄糖和木糖生产乙醇则成为了当前的研究热点。根据科研报道，主要研究包括两个方面：(1)通过基因重组技术将表达异源或者同源乙醇合成路径相关的酶的基因导入能够利用葡萄糖和木糖的微生物受体细胞中进行发酵生产乙醇；(2)通过基因重组技术将与木糖利用相关途径的酶的基因导入能够生产乙醇的微生物中。目前，科学家已研究报道了一系列的重组微生物，可利用葡萄糖和木糖生产乙醇。然而，当利用重组微生物发酵生产乙醇时，乙醇发酵的成功与否取决于在发酵过程中对各种环境压力的耐受能力。根据研究报道，发酵过程中不断增加的乙醇浓度所产生的压力是限制乙醇生产和最终阻止乙醇发酵的重要因素之一。因此，如何提高重组微生物的乙醇耐受性是第二代燃料乙醇技术迫切需要解决的问题。通过基因重组手段，改良微生物中的乙醇敏感相关基因无疑是提高微生物的乙醇耐受性能的一个重要解决方案。因此，寻找微生物中的乙醇敏感的关键基因靶点，对相关基因改良，对进一步提高乙醇发酵得率有着非常积极的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的专利技术目的在于提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用及利用该基因提高微生物短链醇耐受性的方法。本专利技术发现了该基因对短链醇敏感，与微生物对短链醇的耐受相关，可应用于短链醇耐受靶点。为了实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用，该基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：I具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；II具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1的所示核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。大肠杆菌虽然不能天然高效合成乙醇，但它具有生长快速、培养简单、遗传背景清晰、底物利用宽泛、能够利用木糖为单一碳源快速生长等优点，是异源构建乙醇合成路径的良好宿主。上世纪90年代，Ingram课题组将来自运动发酵单胞菌中的PET操纵子导入大肠杆菌W中，成功构建筛选了一株高产乙醇的重组大肠杆菌KO11，它在复杂培养基中的乙醇得率超过100％，是目前报道的共利用葡萄糖和木糖产乙醇最具潜力的菌株之一。然而，菌株KO11的乙醇耐受性较差，当乙醇浓度达到35g/L时生长几乎全部被抑制，其乙醇耐受力较低，严重限制了菌株发酵生产乙醇的产量。本专利技术通过探究菌株KO11乙醇耐受能力差的原因，寻找到一个新的乙醇敏感性基因。该基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。该基因在NCBI公布的大肠杆菌KO11基因组上的基因编号为EKO11_3023，由于该基因编码假设蛋白，具体功能尚不知。在本专利技术中，根据本专利技术鉴定的功能(乙醇敏感性蛋白-ethanolsensitiveproteinA)将该基因命名为espA。实验结果证实，将大肠杆菌KO11中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在乙醇中的耐受性。在本专利技术的另外一些实施例中，实验结果还发现，将微生物中的该基因敲除掉之后，能够显著提高所得重组菌株在异丙醇或正丁醇中的耐受性。说明该基因与微生物对短链醇的耐受有一定的关联。优选地，本专利技术提供的应用中的短链醇为乙醇、正丙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的应用中的短链醇为乙醇、异丙醇或正丁醇。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的应用中的短链醇为乙醇。优选地，本专利技术提供的应用具体为作为短链醇筛选标记基因。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的应用具体为作为短链醇筛选标记基因时，可将该基因作为反向筛选标记，将此基因作为质粒筛选标记，用短链醇作为筛选压，反向筛选。这和抗性筛选相反，即不生长的重组微生物含有目标质粒。也可以将该基因作为正向筛选标记，将此基因导入质粒中，同时将酶切位点设计在这个基因内部，所设酶切位点不改变基因翻译之后所得的氨基酸序列，将后续目标基因插入此酶切位点而使其失活，用短链醇作为筛选压，短链醇抗性高的菌株中的质粒即含有目标基因。用该基因作为短链醇筛选标记基因时，区别于其它常用抗性基因标记基因。以质粒为例，现有的以抗性基因作为标记基因的质粒的多克隆位点与抗性基因标记各自独立，抗生素压力只能筛选质粒是否转化成功，不能说明质粒是否含有目标插入基因，需要蓝白斑筛选辅助验证目标基因的插入，且该方法存在较高的假阳性且验证较为繁琐；而用本专利技术中的短链醇敏感基因作为标记，将克隆位点和短链醇耐受筛选标记合二为一，单用短链醇压力筛选，短链醇耐受性提高的即为插入有目标基因的质粒，可以简化筛选步骤并提高目标基因插入验证的正确率。优选地，本专利技术提供的应用具体为提高微生物短链醇耐受性。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的应用中所述针对的微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的应用中所针对的微生物为大肠杆菌时，具体为大肠杆菌W或其衍生菌株。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的应用中所针对的微生物为大肠杆菌W衍生菌株时，具体为大肠杆菌KO11。本专利技术还提供了一种提高微生物短链醇耐受性的方法，包括：取微生物，敲除短链醇敏感基因，获得重组微生物；该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：I具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；II具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。优选地，本专利技术提供的方法中的微生物为大肠杆菌或沙门氏菌。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的方法中的微生物为大肠杆菌时，具体为大肠杆菌W或其衍生菌株。在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的方法中的微生物为大肠杆菌W衍生菌株时，具体为大肠杆菌KO11。优选地，本专利技术提供的方法中，步骤2中的同源重组所用重组系统为Red重组系统。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的方法中，当大肠杆菌为大肠杆菌W或其衍生菌株时，包括以下步骤：步骤1：构建获得包含筛选标记基因和短链醇敏感基因的上、下游同源序列的基因敲除盒；步骤2：将步骤1所得基因敲除盒导入大肠杆菌中，通过同源重组，敲除大肠杆菌中的短链醇敏感基因；该短链醇敏感基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：I具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；II具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因在作为短链醇耐受靶点上的应用，所述基因具有I或II所示的核苷酸序列中的任意一个：I具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；II具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种基因作为大肠杆菌短链醇耐受靶点的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述应用为作为短链醇耐受筛选标记基因。2.一种基因作为大肠杆菌短链醇耐受靶点的应用，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述应用为敲除所述基因提高大肠杆菌短链醇耐受性。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述短链醇为乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或丁二醇。4.一种提高微生物短链醇耐受性的方法，其特征在于，包括：取微生物，敲除短链醇敏感基因，获得重组微生物；所述短链醇敏感基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述微生物为大肠杆菌。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，陈艳，李炳志，李霞，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12